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《甘肃农业大学》 2004年
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大鼠RSA14-44基因功能的初步研究

袁莉刚  
【摘要】:在本研究中,选择RSA14-44基因作为研究对象。RSA14-44基因位于大鼠染色体4q31,该基因是中国协和医科大学医学分子生物学国家重点实验室通过激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)技术,构建大鼠初级精母细胞cDNA削减文库,并进一步用斑点杂交(Dot Blotting)分析,通过在互连网上的比对获得的。全长为1124bp,可读编码框自100bp_684bp,编码194个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为21.8Kda。 首先,我们利用RT-PCR检测了RSA14-44在多个组织中的表达,证明其在睾丸、附睾入脑组织中的呈高表达,这为进一步对其其功能的研究提供了新的思路。 其次,将RSA14-44 cDNA克隆到pET30a(+)载体,在大肠杆菌中进行了pET30a(+)-14融合蛋白的表达与纯化。以纯化的pET30a(+)-14融合蛋白免疫新西兰大白兔,最后获得了抗pET30a(+)-14融合蛋白的多克隆抗体。利用该抗体进行的免疫组化研究显示,RSA14-44蛋白定位于大鼠睾丸生精上皮组织中的初级精母细胞的细胞质部位和支持细胞,而在已经变形的精子细胞中则未观察到阳性信号。 最后,我们又构建了包含RSA14-44 cDNA的pAS2-1-14载体,并以其作为诱饵质粒,进行人睾丸cDNA文库的酵母双杂交筛选,获得了一条编码人20S蛋白酶体蛋白PSMB5的cDNA片段,PSMB5蛋白氨基酸序列全长为264个氨基酸,我们所获得的序列编码该3’端蛋白编码框内全部氨基酸(191个氨基酸)。PSMB5蛋白是26S蛋白酶体的一个重要组成部分,是泛素-蛋白酶体体系(Ubiquitin-proteasome system)的核心,主要对细胞内发生错误折叠、突变或非正常的短期存在的蛋白质进行修饰或降解。依据NCBI已有的PSMB5核苷酸序列设计引物,利用PCR技术成功克隆了PSMB5的cDNA编码区的部分序列。将PSMB5 cDNA克隆到表达载体pET-30a(+)和pGEX4T-1中,进行了His-tagged-PSMB5和GST-PSMB5融合蛋白的原核表达,并利用表达蛋白验证了PSMB5和RSA14-44蛋白体外结合。同时,构建了pCDNA-Flag-PSMB5真核融合蛋白克隆,用于转染Hela胞和CHO细胞,进一步在真核细胞体内验证了RSA14-44和PSMB5的结合。将RSA14-44cDNA和PSMB5克隆到pEGFP-N1载体,构建成功绿色荧光融合表达质粒pEGFP-N1-14和pEGFP-N1-PSMB5,将两种质粒载体分别转染CHO细胞后,借助碘化丙啶染色的细胞化学荧光技术和激光共聚焦显微镜观察发现,RSA14-44蛋白都定位在CHO细胞的细胞质,PSMB5在胞质和胞浆中均有表达。将RSA14-44和PSMB5 cDNA分别克隆 博士学位论文 摘要 P占外拐J蛋白存在相互作用,为此,我们研究了RSA14一44和尸5外招J相互作用后对泛素 水解酶酶活性的影响,发现二者单独作用时都可显著提高泛素水解酶酶活性,共同 转染细胞时极显著地提高了酶活性,这表明两者相互作用可能对生物学功能具有协 同作用。 研究中酵母双杂交实验及体内外验证的结果首次表明,RSA14一44和p占外拐J蛋白 在体内外存在相互作用;从尺SA14一44和只5外拐J蛋白在细胞及组织中的定位,细胞蛋 白酶体活性分析结果推测,在精子发生过程中,RSA14一44和尸5外招J相互作用,在生 殖细胞中调节细胞的增殖和分裂,在支持细胞中两者协同来调节精子发育过程中的 蛋白降解。 关键词:RsA14一4 酵母双杂交蛋白表达 205及265蛋白酶体
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q75

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 梁俊波;与睾丸高表达蛋白质RNF138相互作用的蛋白激酶NLK的功能研究和睾丸特异表达蛋白质RSA-14-44的功能研究[D];北京协和医学院;2010年
【共引文献】
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2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
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7 任华;顾建华;孙竹筠;沈万赟;吴鹰;周忠良;;RT-PCR法检测斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA表达[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
8 马珺;陈云霜;王爱善;李仲逵;;珍稀鸟类东方鹳的性别鉴定[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
9 马勋;陆承平;;猪戊型肝炎病毒新疆分离株全基因序列的分析[A];中国科协2005年学术年会“新疆现代农业论坛”论文专集[C];2005年
10 吴晓娟;冷梅;赵大鹏;崔颖杰;张岩;汪春义;戚凤春;郭新;付学奇;;带有IL-2基因佐剂的乙肝病毒DNA疫苗构建及其免疫效果的观察[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
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4 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
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10 吴健;肝移植病人乙型肝炎病毒再感染的临床和基础研究[D];浙江大学;2001年
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3 郭巍;苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究[D];东北农业大学;2000年
4 刘怀然;鸡传统性法氏囊病抗独特型抗体疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
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10 刘成龙;大鼠脊髓损伤后一氧化氮合酶活性及其基因表达动态变化的研究[D];第一军医大学;2000年
【同被引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 张晓东;人和大鼠精子发生相关基因的克隆及其基因结构和功能分析[D];中国协和医科大学;2000年
2 张宁;GTPase蛋白RSA-14-44的功能研究[D];中国协和医科大学;2008年
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10 史海水,梁华平,徐祥,李生茂;NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化[J];河北大学学报(自然科学版);2005年05期
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3 袁顺宗;谭江琳;彭旭;马兵;贺伟峰;黄正根;程文广;贾雄飞;王晓娟;甘成军;胡婕;陈希炜;易绍萱;胡晓红;张小容;罗高兴;吴军;;荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
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5 袁顺宗;谭江琳;马兵;彭旭;贺伟峰;黄正根;程文广;贾雄飞;王晓娟;胡婕;甘成军;陈希炜;胡晓红;张小容;罗高兴;吴军;;激光共聚焦技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
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2 金陵;融合蛋白试剂首次出口美国[N];中国医药报;2010年
3 吴红梅;我省首批融合蛋白试剂出口美国[N];新华日报;2010年
4 记者 张晔 通讯员 刘宁春;一种有效治疗冠心病的融合蛋白发现[N];科技日报;2009年
5 通讯员 沈季 记者 张兆军;抗肿瘤融合蛋白进入临床试验[N];科技日报;2005年
6 记者 魏巍 通讯员 沈季;吉大一抗肿瘤新药进入临床试验阶段[N];长春日报;2005年
7 刘燕玲;中药与基因功能调控[N];健康报;2003年
8 冯卫东;抑制蛋白相互作用可成为治癌新方法[N];科技日报;2009年
9 本报实习记者 朱永基 本报记者 郑颖璠;期待基因功能解读[N];健康报;2010年
10 李爱铭;解读哺乳动物基因功能[N];解放日报;2005年
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1 袁莉刚;大鼠RSA14-44基因功能的初步研究[D];甘肃农业大学;2004年
2 柏亚铎;犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D];中国农业大学;2005年
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4 王玉梅;嵌合降钙素基因的构建及表达[D];中国海洋大学;2005年
5 徐海燕;人BAFF基因转染细胞及其单克隆抗体的生物学特性[D];苏州大学;2005年
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7 蒋骅;GST-EGFR融合蛋白冲击树突状细胞治疗头颈部鳞状细胞癌体内外实验观察[D];浙江大学;2008年
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9 刘荣;人4-1BBL/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20双功能抗体的细胞毒作用及其机制研究[D];中国协和医科大学;2010年
10 钟根深;以明胶酶为靶点的小型化抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性的研究[D];中国协和医科大学;2010年
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3 万一;人TNF-α自体疫苗的研究[D];第四军医大学;2004年
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7 陈小颖;ω-芋螺毒素M ⅦA的表达与纯化[D];浙江大学;2004年
8 徐忠林;共表达NDV F 基因与H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[D];扬州大学;2005年
9 王刚;志贺毒素B亚单位与柯萨奇病毒B组3型VP1融合DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察[D];河北医科大学;2005年
10 孙元田;人神经营养素-4的原核表达与纯化[D];四川大学;2005年
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