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《甘肃农业大学》 2004年
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应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究

张宁  
【摘要】:干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子,许多重要的农作物如水稻、马铃薯、烟草等对干旱和盐碱比较敏感,缺乏有效的耐旱机理,经常因干旱和盐碱造成严重的产量损失。培育抗旱耐盐农作物新品种是利用干旱盐碱地最为经济、有效的措施。随着现代分子生物技术的飞速发展,通过基因工程技术改良农作物抗旱耐盐性工作取得了很大的进展。高等植物适应环境胁迫的重要生理机制之一是渗透调节,甜菜碱是其中最重要的渗透调节物质之一。而且它的合成途径简单,对细胞无毒害,具有稳定酶和细胞膜结构,清除过氧化物等非渗透保护功能,被认为是最有希望的渗透调节物质之一。 许多农作物如水稻、马铃薯、烟草、番茄等自身并不能积累甜菜碱,如果利用基因工程技术,把与甜菜碱合成相关的基因转入农作物,使其积累甜菜碱,将有可能达到增强农作物抗旱耐盐性的目的。迄今为止,已有不少植物被成功地导入了与甜菜碱合成相关的基因,并在不同程度上提高了这些植物的抗旱耐盐性。 本研究的主要目的是从菠菜中分离合成甜菜碱的关键酶甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因,从拟南芥中分离干旱、盐碱、低温及ABA诱导型启动子rd29A,构建CaMV 35S 和rd29A启动子驱动的BADH基因表达载体,然后转入优良马铃薯栽培品种中,提高其抗旱耐盐性。同时,研究不同启动子驱动的外源基因在逆境胁迫下高效表达的分子机理,为丰富植物转基因理论和培育抗逆作物新品种提供理论依据。取得的主要研究结果如下: 1.从菠菜叶片中分离了BADH基因的cDNA,序列分析结果表明该基因含有1494 bp长度的开放阅读框,编码497个氨基酸。核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的菠菜BADH基因具有99.87%的同源性,与其它植物的BADH 基因也有80%以上的同源性。Northern杂交结果表明,BADH mRNA转录水平随盐浓度的增加而提高,经500 mmol/L NaCl持续处理4 d 时,BADH基因的转录约为对照水平的4倍。随着干旱胁迫天数的增加,菠菜叶片中BADH mRNA含量明显增加。这些实验结果表明菠菜BADH 基因的表达受盐胁迫和干旱胁迫的诱导。 2.从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列,序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行的GUS基因Northern杂交和GUS活性组织染色的分析结果是一致的,未受诱导处理的转基因植株GUS基因有微弱表达,而逆境4℃低温、100 μmol/L ABA、缺水和250 mmol/L NaCl胁迫处理24 h均可诱导GUS大量表达,且rd29A启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性。 WP=8 3.将BADH基因分别与组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A融合,构建了植物表达载体pBIBB和pBIrB,通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中,经酶切鉴定和PCR检测证明表达载体已导入农杆菌中。 4.用组成型启动子CaMV 35S驱动的BADH基因表达载体pBIBB转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株。经PCR、Southern、Northern杂交,证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。对获得的转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性进行了测定,结果显示未转基因的对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1-1.0 U/mg之间,转BADH基因的烟草在盐胁迫和PEG条件下,生长状态良好,生长势强于未转基因的植株。说明本实验克隆的BADH基因能在异源植物中进行正常翻译表达。 5.以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料,分别用组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A驱动的BADH基因表达载体pBIBB和pBIrB进行遗传转化,获得了转基因马铃薯。通过PCR扩增和Southern杂交表明BADH基因已整合到受体马铃薯的基因组中。Northern杂交分析表明,未转基因的马铃薯对照中检测不到BADH基因的转录产物;转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中,BADH基因仅有微弱表达,在受干旱和NaCl胁迫的诱导时BADH基因才会较强地转录;但在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中,BADH基因的表达较强且不受胁迫条件诱导。 6.BADH酶活性分析表明,在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中,各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似,但在不同的转基因个体间BADH酶活性差异较大,变化范围在2-11 U之间,而对照检测不到。BADH酶活性与叶片的相对电导率有一定的负相关关系(y=-3.7264x+57.898,r2=0.9202),说明BADH酶活性越强,对植株细胞膜通透性的保护能力越强,证明外源BADH基因的导入,确实提高了转基因马铃薯植株在干旱和盐胁迫条件下的抗性。在转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中,植株在未经胁迫时,BADH酶活性很低,但当转化植株分别经NaCl和PEG胁迫后,BADH酶活性显著提高,其活性值在10-12 U之间,而且株系间差异很小,表明转rd29A启动子驱动的BADH基因的不同马铃薯株系抗旱耐盐能力相近。 7.对转基因马铃薯植株的形态学观察表明,转基因植
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