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《甘肃农业大学》 2004年
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一氧化氮调节胚胎植入的信号通路及其分子机制

沈政  
【摘要】:一氧化氮(nitric oxide,NO ) 是一种无机自由基气体,作为一种特殊的生物传递信号分子,日益受到生命科学各领域的普遍重视。机体内的NO是通过三种一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)合成。NOS在体内的分布极为广泛,几乎遍布机体的每一个系统。研究表明,哺乳动物雌性生殖过程中的重要环节,诸如卵泡的发育和成熟、胚胎的植入、妊娠的维持、分娩等许多生理过程中,NO发挥重要的调节作用。 为探讨NO在哺乳动物胚胎植入过程中的信号通路及分子机制,本研究应用小鼠胚胎植入的体外模型,将常规方法获取的胚泡随机培养在含有不同处理药物的培养液中,在培养12、24和36 h后分别观察、统计胚泡黏附、扩展的情况,同时收集培养液,用明胶酶谱法分析其中MMP-2蛋白的变化,半定量RT-PCR分析各组胚泡中MMP-2 mRNA的变化。研究结果表明,500μM NOS抑制剂L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)可以显著抑制小鼠胚泡的黏附、扩展及MMP-2的分泌(P0.05),此抑制可以被同时加入的100μM NO供体S-亚硝基-乙酰青霉胺(SNAP)逆转(P﹥0.05)。提示NO对小鼠胚泡体外黏附、扩展及MMP-2的分泌具有重要的影响。此外,在使用NOS抑制剂500μM L-NMMA时,同时加入20μM的cGMP类似物8-Br-cGMP,也可以逆转这种抑制效果,胚胎的黏附和扩展与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结果进一步提示,NO对小鼠胚胎黏附、扩展及MMP-2的分泌影响可能是通过其下游分子cGMP通路进行,而且对MMP-2的作用可能是在基因水平进行调节。 为了进一步了解NO调节胚胎植入过程的分子机理,将eNOS基因转入作为研究植入的模式细胞JAR当中,建立可控的内源表达NO的模型。应用脂质体介导转染技术将人内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因转入JAR细胞,获得转染阳性细胞。用RT-PCR和Western blot技术从基因及蛋白水平对表达产物进行鉴定,结果显示,阳性细胞有较高水平的mRNA转录和特异目的蛋白表达并通过免疫细胞化学方法获得证实,与对照组相比,转染eNOS基因的阳性JAR细胞 WP=6 高表达外源eNOS蛋白;但是一氧化氮合酶(NOS)活性及其催化产物NO并没有直接升高;但使用适当浓度的钙离子激动剂A23187处理则能增加NOS的活性。这些结果说明,在转染的JAR细胞中,eNOS已得到表达,但没有被直接激活。 实验过程中,使用0.5μM A23187对转染阳性组(EA)与转染阴性组(MA)进行诱导,并与转染阴性非诱导组(M)及对照组(C)进行比较,差异均不显著(P0.05);使用2μM A23187进行诱导,EA组与MA组、M组和C组比较,差异显著(P0.05),但MA与M组及C相比NO增加,但统计分析差异并不显著;用8μM A23187进行诱导,EA组与ME组与C组相比,差异极显著(P0.001);而MA组在该剂量的A23187作用下,与E组及C组相比,NO产生差异显著(P0.05)。 这样用8μΜA23187诱导的转染组,建立一个产生内源NO的细胞模型。应用该转染细胞模型分别产生高、低浓度NO,进行细胞增生、迁移及MMP-2分泌实验;同时用外源NO供体SNAP分别以低浓度50μM(S1)和高浓度500μM(S2)分别处理JAR细胞,进行上述增生、迁移和MMP-2分泌实验。结果显示,EA组与M组相比,对细胞的迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的抑制作用(P﹤0.05);相反MA组与M组相比细胞的迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的促进作用(P0.05);而M组与C组无明显差异(P0.05)。同时用外源NO供体50μM的SNAP处理细胞与C组相比,对细胞迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的促进作用(P0.05);500μM SNAP处理细胞与C组相比则对迁移、增生及MMP-2分泌具有抑制效应(P﹤0.05)。应用免疫印迹分析,Akt/PKB Ser-473磷酸化状态均发生相应的变化,提示NO可能通过Akt/PKB信号通路影响MMP-2分泌及细胞增生、迁移。 本研究首次系统地说明,在JAR细胞中,无论是内源产生NO或是外源NO,由于NO的浓度差异,造成NO对细胞迁移、增生和MMP-2分泌具有不同的作用,NO在低浓度时起促进作用,高浓度时起抑制作用;而调节过程可能是通过激活Akt/PKB信号通路而使Akt/PKB Ser-473磷酸化起作用。 整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)是新近发现的一种分子,该分子对细胞的生理功能和病理过程具有重要作用。本研究用野生型(WT-ILK)、酶灭 WP=7 活型(KD-ILK)及其空载体(Mock) 三种表达质粒转染JAR细胞,进而研究ILK对NO的调控作用。结果表明, 与M组相比,转染WT-ILK组细胞产生NO的量显著增加(P0.05);而转染KD-ILK组细胞产生的NO与M组相比却显著降低(P0.05),而转染空载体M组与对照组相比,无显著差异(P﹥0.05)。各实验组中NOS变化与NO相似,这些结果说明ILK通过激活NOS促进NO的产生。用MTT法测定各组细胞增生情况,发现WT-ILK转染组明显高于对照组(P0.05);而转染KD-ILK则低于对照组,差异显著(P0.05)。同时用明胶酶谱方法分析MMP-2的变化,转染WT-ILK质粒的细胞MMP-2分泌与对照组比较,MMP-2分泌显著增加(P0.05),而转染KD-ILK的细胞MMP-2分泌量与对照组相比,显著降低(P0.05)。然后用免疫印记迹的方法分析eNOS及Akt/PKB Ser-473磷酸化的变化,与NO变化保持平行。本研究说明,ILK可以通过eNOS来产生NO,而对eNOS的调节可能是通过Akt/PKB信号
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S814.8

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