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ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体的构建及玉米遗传转化研究

郭志鸿  
【摘要】:真菌性病害长期以来一直是限制玉米产量、影响玉米品质的主要病害,严重影响着玉米生产的发展。常规育种技术不仅育种周期长,耗时费力,难以满足生产上对抗病良种的需要,更重要的是玉米抗性资源比较缺乏,限制了传统方法在玉米抗病育种中的成效。基因工程技术在玉米育种上的应用,可以将存在于其它物种的抗病基因引入到玉米种质材料中,提高玉米抗病性,加速抗病育种进程, 芪类物质作为一类具有广谱抗性的植物抗毒素,对多种真菌、细菌和病毒都有一定的抗性,在植物的早期防御系统中起着极为重要的作用。更值得一提的是,芪类物质具有一定的药理作用,对人体健康特别有益。芪合酶是芪类物质合成的关键酶,通过一步反应即可丙二酰-CoA和香豆酰-CoA转化为芪类物质。而作为底物的丙二酰-CoA和香豆酰-CoA普遍存在于植物体内,所以克隆芪合酶基因并将其导入受体植物,就有可能促进转化植物中的芪类物质的合成,进而提高其抗病水平。故本研究采用基因工程的技术手段,克隆花生的芪合酶基因并将其导入玉米优良自交系,以期增强玉米的对真菌性病害的抗性,改善玉米品质。 本研究采用PCR扩增技术,克隆了编码玉米泛素蛋白(polyubiquitin)基因启动子(ubi-1启动子)及该基因的5’端非编码区(5’UTR)和第一个内含子区域。与GenBank中公布的序列相比,克隆的序列在899bp长的启动子区域只有三个碱基发生点突变,二者同源性为99.97%,且突变均未发生在TATA框等各主要调控序列区域;5’端非编码区和第一个内含子区与GenBank中公布的相应区段的同源性为98.69%。将ubi-1启动子和polyubiquitin基因5’端非编码区置于绿色荧光蛋白基因(GFP)的上游端,构建了具有ubi-1启动子-polyubiquitin基因5’UTR-GFP-终止子表达单元的植物表达载体pBIUG。用基因枪法将其导入洋葱表皮细胞,瞬时表达检测到被转化细胞呈显绿色荧光,进一步证明了该启动子具有活性。 采用RT-PCR技术,从花生叶片中克隆了芪合酶基因(Res)。序列分析表明,本研究克隆的花生芪合酶基因序列与GenBank中注册的序列同源性达93.25%,两者编码的氨基酸序列相似性为98.2%,其中改变的氨基酸在相对次要的位置,并未改变芪合酶活性中心氨基酸(C164位的半胱氨酸),理论上讲这一基因的表达产物应具有正常的活性。 以pBI121为基础载体,构建了具有玉米泛素蛋白(polyubiquitin)基因启动子ubi-1和5’端非编码区及其第一个内含子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体pBIUA。 WP=7 采用基因枪法分别对玉米优良自交系综31和郑22的Ⅱ型胚性愈伤组织进行了遗传转化研究,初步得出基因枪法转化玉米Ⅱ型愈伤组织的优化参数为:金粉用量为60 μg/B,轰击次数为两次,发射点与靶细胞的距离为9cm时,转化效率高而且经济。 对玉米再生体系的研究得出:胚龄对胚性愈伤组织的诱导率影响较大,授粉后10天左右的幼胚形成愈伤组织的能力最强,过大或过小都不利于胚性愈伤组织的诱导;培养基中2,4-D的浓度对胚性愈伤组织的诱导影响极大,且不同的基因型,其最大胚性愈伤组织诱导率所需2,4-D浓度也不一样,其中有利于“综31”形成愈伤的2,4-D最适使用浓度为1.5mg/L,“郑22”为2.0mg/L。此外,玉米ⅡⅡ型胚性愈伤组织分化成苗时不同基因型所需的最适6-BA浓度也不同,“综31”和“郑22”愈伤组织分化成苗的最适6-BA浓度分别为1.0 mg/L和0.5 mg/L。以优化的基因枪转化再生体系对这两个自交系幼胚进行了大批量转化,最终获得了6株再生植株。 资料检索结果表明,到目前为止尚未有将芪合酶基因导入玉米的报道。


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