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苜蓿植株再生体系的建立及sacB基因转化的影响因素研究

张静妮  
【摘要】:针对目前面临的生态环境问题,培育出能够适应干旱、半干旱和盐碱地的苜蓿草种将有利于生态环境的恢复和治理。同时抗旱、耐盐碱苜蓿转基因新品种的培育和推广也必将带来很好的社会和经济效益。借助植物基因工程手段提高苜蓿抗旱性是现代育种的重要途径。 本文探讨了5 个苜蓿品种(秘鲁、富平、甘农1 号、甘农2 号、甘农3 号)的组织培养程序,确定出再生能力最强的品种及外植体。利用农杆菌介导法转化sacB(果聚糖合成酶)基因,建立了一套农杆菌介导苜蓿基因转化的优化体系, 主要研究结果如下: 1 组培再生体系的建立。实验表明,苜蓿不同品种间再生能力差异较大,在实验所采用的5个品种中再生能力的强弱依次为秘鲁富平甘农3号甘农 2 号甘农1 号。在苜蓿愈伤组织诱导中,子叶节是最佳的外植体材料。秘鲁、富平、甘农3 号的最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D2.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L,愈伤组织诱导率都在95%以上。甘农1 号和甘农2 号的最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 4.0mg/L+蔗糖30 g/L,愈伤组织诱导率分别为65.6%、73.3%。5 个品种最适的分化培养基为MS+KT1.0 mg/L +NAA0.5mg/L +蔗糖20g/L 或MS+BA4.0mg/L,可诱导出绿点状体细胞胚,之后转入MS+BA0.5 mg/L 的分化培养基中可分化不定芽,分化率因品种不同而各有差异,秘鲁、富平、甘农3 号不定芽的分化率可达到70%左右,而甘农1 号和甘农2 号的分化率在30%左右。最佳诱导生根的培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L。综合考虑各品种再生能力的强弱,最后确定以秘鲁苜蓿作为基因转化受体。 2 sacB 基因转化体系的建立。在愈伤组织诱导阶段加入卡那霉素对芽的分化有抑制作用,因此推迟选择15 天进行抗性芽的筛选,提高了转化效率。本文以侵染后外植体的抗性愈伤组织出愈率和抗性芽形成率及抗性苗的获得为指标建立了转化体系:以子叶节为受体材料,脱菌中使用500mg/L 的羧苄青霉素,菌液浓度为OD6000.5,共培养3 天, 60mg/L Kan的选择压下筛选80 多天。通过上述转化体系获得了3 株抗卡那霉素的再生植株。


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