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用Real Time PCR和DGGE技术研究放牧藏系绵羊瘤胃微生物季节动态

淡瑞芳  
【摘要】: 藏系绵羊主要分布于西藏、青海、甘肃和四川等高寒地区,是具有特殊遗传特性的动物,是当地牧民生活的物质基础和经济来源。与其它反刍动物一样,藏羊在进化过程中获得的前胃发酵功能也非常完善和高效。与其它反刍动物不同的是,藏羊所生存环境的更加恶劣,饲料来源更加困难,饲料的营养成分也更加贫乏,但环境胁迫使其对饲料的利用更为高效,瘤胃的发酵功能更为完善,为它的生存提供了重要保障。研究瘤胃微生物的目的,是为了了解它们的形态、生理、繁殖、地理分布、种群相互作用及与宿主之间的相互依赖关系,为合理利用饲草、饲料资源提供依据。本论文对不同季节青藏高原放牧藏系绵羊瘤胃细菌、真菌、甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的数量动态变化进行了研究,并分别对不同季节藏系绵羊瘤胃细菌和古细菌区系的动态进行了研究。共进行了以下四个试验: 试验一:采用模拟采食,结合尼龙袋法的方法,测定了试验羊放牧地(青海三角城种羊场)冬春季、夏季和秋季各牧场的牧草营养成分、放牧采食量和消失率。结果表明:牧草营养成分(混合草样)随季节变化,其中粗蛋白质、能量含量均为夏季秋季冬春季;中性洗涤纤维,酸性洗涤纤维含量为夏季秋季冬春季。春、夏、秋和冬季牧草干物质的消失率分别为:48.81±8.25%、52.07±1.03%、51.43±3.05%、50.28±1.23%。春、夏、秋和冬季绵羊CP、ME食入量为:2.63±0.01g/kgW0.75·d、0.41±0.00 MJ/kgW0.75·d,12.80±0.08g/kgW0.75·d、1.33±0.01MJ/kgW0.75·d,6.39±0.03g/kgW0.75·d、0.57±0.002 MJ/kgW0.75·d,4.05±0.01 g/kgW0.75·d、0.39±0.003 MJ/kgW0.75·d。 试验二:以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物为样品,以获取尽可能全面代表瘤胃微生物种类、不被其它来源DNA污染的可用于分子生物学研究的总DNA为目的,采用改进后的液氮反复冻融+CTAB法提取微生物总DNA。提取瘤胃微生物总DNA长度在23Kb以上,OD260/OD280均在1.59-1.68。用细菌和古细菌的16S rDNA通用引物和特异引物,从纯化前后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带,表明该法能充分破碎包括细菌、真菌在内的各种瘤胃微生物细胞壁。 试验三:以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物样品总DNA,研究不同季节藏系绵羊瘤胃微生物的季节变化。采用Real Time PCR技术,利用国际原子能机构提供的细菌、真菌、产甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌的引物,在建立了瘤胃微生物


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