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牦牛胚胎附植过程中细胞凋亡及其通路的研究

巨向红  
【摘要】: 为了阐明:(1)牦牛胚胎的附植模式、相关细胞的变化规律及滋养巨细胞(TGC)的迁移规律,(2)牦牛胚胎附植过程中子宫内膜细胞(EC)和滋养层细胞(TC)的凋亡规律,(3)增殖因子Ki-67在牦牛胚胎附植过程中的表达变化特征,(4)凋亡相关蛋白Fas/FasL、TNFα/TRADD(TNFα相关的死亡受体)、Bcl-2/Bax、caspase-3和caspase-9在牦牛胚胎附植过程中的表达特征及其细胞发生凋亡的可能通路,本研究选用青海省大通牦牛育种场成年健康母牦牛15头,分别在配种后的第16、18、20、22和24天屠宰后取子宫样品进行实验(每组3头)。运用光镜、扫描电镜和透射电镜观察了牦牛胚胎附植过程中EC、胎儿TC和黏附结构的变化规律;用光镜、电镜、原位凋亡细胞荧光检测法(DAPI法)和DNA原位末端标记(TUNEL法)检测了胚胎附植过程中牦牛EC和TC凋亡的变化规律;用免疫组织化学法(SP法)检测了牦牛胚胎附植过程中EC和TC凋亡相关蛋白Fas/FasL、TNFα/TRADD、Bcl-2/Bax、caspase-3和caspase-9的表达特征。结果发现:(1)牦牛胚胎附植开始于妊娠的17-18天,此时胎儿TC与子宫内膜上皮(EEC)发生了轻微的并置与黏附,滋养层单核或双核细胞(BNC)侵入子宫上皮是附植开始的标志。整个胚胎附植过程一直伴随TC侵入子宫内膜或与子宫内膜上皮细胞发生融合的现象。双核细胞最早出现在妊娠18天。大量的糖原颗粒分布于上皮细胞游离端,并向滋养层扩散。TC与EEC间以微绒毛镶嵌为主要连接方式,有时出现桥粒或简单连接。牦牛妊娠期子宫上皮多核细胞,至少部分是由滋养层细胞的迁移或与子宫内膜融合而产生;(2)在胚胎附植过程中,各种细胞均可发生凋亡。HE染色时凋亡细胞表现为核浓缩或形成凋亡小体而深染,胞质有空泡化现在。DAPI标记时凋亡细胞核发强烈的蓝色荧光。DNA末端原位标记(TUNEL)下凋亡细胞核散发强烈绿色荧光,有时可见凋亡小体。在牦牛胚胎附植早期,凋亡细胞的主要特征为核浓缩,而到附植的后期,凋亡细胞的特征则主要为大量凋亡小体的形成及胞浆空泡化,并以单核巨细胞的凋亡为主。子宫内膜基质细胞和血管内皮细胞的凋亡特征为核质浓缩。电镜下凋亡细胞的特征主要为核浓缩、细胞体积变小及大量的凋亡小体形成。牦牛子宫内膜上皮细胞的凋亡率在妊娠16天最低,仅为6.83%。在妊娠的18-22天,凋亡率升高,分别为16.17%,16.0%和13.81%。而到妊娠的第24天最高,达22.82%,与妊娠16天的凋亡率差异显著(P0.05)。牦牛胎儿TC的凋亡率在附植过程中的变化不大,最高为18.3%(第16天),而最低为13.38%(第18天)。从总体趋势来看,在胚胎附植的过程中,牦牛EEC的凋亡率有增高趋势。而滋养层细胞在附植过程中的凋亡率变化不大。在牦牛胚胎附植的不同阶段,子宫内膜和滋养层上均可见Ki-67阳性细胞。有时阳性细胞在子宫内膜上皮或滋养层中成团分布。在子宫腺上皮细胞中,Ki-67阳性细胞较少。在牦牛胚胎附植过程中,EC中的增殖因子Ki-67阳性细胞率一直较高。在妊娠16天为42.25%,到妊娠18天最高,达57.75%,随后缓慢下降,到妊娠24天时,仅为26.88%。而在滋养层上中的变化规律


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