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《甘肃农业大学》 2008年
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兔出血症病毒诱导BHK-21细胞凋亡及其VP60蛋白单克隆抗体制备

魏威  
【摘要】: 兔瘟是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。目前关于RHDV的致病机理还不完全清楚,据报道RHDV可以在体内诱导肝细胞和血管内皮细胞发生凋亡,推测细胞凋亡可能是RHDV致病的一种重要机制。RHDV衣壳蛋白VP60是病毒的主要免疫蛋白,可以诱导机体产生保护性中和抗体,研制其单克隆抗体,对于研发诊断试剂以及分析VP60的抗原表位等具有重要意义。 【目的】本研究拟对RHDV体外诱导BHK-21细胞的凋亡现象进行系统研究,以期探讨RHDV诱导细胞凋亡的特征及其可能的信号通路,为阐明RHDV致病机理提供一定的理论依据;以RHDV的重组VP60蛋白为抗原,制备其单克隆抗体,为研发RHDV诊断试剂及分析VP60抗原表位奠定实验基础。 【方法】主要采用DAPI染色、DNA凝胶电泳、膜联蛋白V-FITC联合PI染色的流式细胞分析等方法对感染RHDV的BHK-21细胞的凋亡状况进行观察和测试;用pET-30a载体原核高效表达RHDV衣壳蛋白VP60,以纯化重组VP60蛋白为抗原免疫注射BALB/c小鼠4次,制取免疫鼠脾细胞,用PEG-3000将其与SP2/0细胞进行融合,制备杂交瘤细胞。经间接ELISA筛选和多次克隆化,获得能分泌RHDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,并用Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测其单克隆抗体的特异性。 【结果】(1)300 TCID50/mL RHDV的感染BHK-21细胞,37℃培养24h后,开始呈现细胞核固缩和梅花状碎裂核,并出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征;培养48h后,细胞染色体抽提物经琼脂糖凝胶电泳检测,可见明显的DNA ladder现象;感染组细胞的Caspase-3活性明显高于对照组细胞。(2)获得2株能分泌RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为细胞株AE11和AH4。两株单抗均能识别纯化RHDV及其重组VP60蛋白,但只有AE11能与RHDV感染的RK-13细胞产生特异性的荧光。 【结论】RHDV在体外可诱导BHK-21细胞发生凋亡,可能通过上调Caspase-3致使细胞凋亡,细胞凋亡可能是RHDV致病的一种重要机制。获得的2株抗RHDV VP60的单克隆抗体可与重组VP60抗原和纯化RHDV抗原发生反应。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.659.7

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【参考文献】
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