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产碱性蛋白酶菌株Bacillus pumilus Zk202的选育与酶学性质研究

褚忠志  
【摘要】: 碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。本论文从盐碱地土壤中分离筛选出一株产碱性蛋白酶的野生菌株Zk202,并进行了菌株的鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学性质的初步研究。研究结果如下: 1.从盐碱地土样中分离到一株耐盐耐碱的芽孢杆菌,其可在NaCl浓度为5%~10%的培养基中生长良好,耐碱性达到pH值为13,经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对,结果表明该菌属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中短小芽孢杆菌的新的亚种,命名为耐盐碱短小芽孢杆菌Zk202。 2.通过紫外线诱变和化学诱变进行复合诱变,结果表明紫外线照射80 sec,DES浓度为2%、处理时间为40 min,菌株产蛋白酶效果最佳。44 h的发酵液酶活力由81 U/ml提高至321 U/ml。 3.通过单因子试验和正交试验,在摇瓶培养条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、接种量等产酶条件进行了优化。得到了菌株的最适产酶条件为:培养基初始pH 9.0,葡萄糖浓度为1.5%,蛋白胨浓度为1.5%,钙离子浓度为0.01%,接种量2%,培养温度为36℃,发酵时间为45 h。在此条件下,碱性蛋白酶的酶活力可达383 U/ml。 4.粗酶液通过硫酸铵盐析沉淀、透析除盐、凝胶柱层析等步骤,对碱性蛋白酶进行了纯化,纯化后的样品经SDS-PAGE得单一酶带。其比活力达到了954 U/mg,纯化了6.13倍,酶活力回收率为27.6 %。 5.通过SDS-PAGE对酶的分子量进行了测定,测得该酶分子量为25000 Da。当以酪蛋白为底物时,其最适作用pH为11,最适作用温度为50℃。


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