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青海血蜱高致病性绿僵菌菌株的筛选及生物学特性

金玉荣  
【摘要】: 金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae(Metschn.)Sorokin.在生物学分类上属于半知菌亚门、丛梗孢目、瘤座孢科、绿僵菌属,是一种广谱性杀虫真菌,能寄生8个目、30个科中的200余种农林害虫。目前,在许多国家已作为重要的生物防治作用物,用于害虫的防治。以绿僵菌作为生防因子的生物防治是控制蜱危害的重要措施。为获得适于田间应用的高毒力绿僵菌菌株,以及探索利用绿僵菌防治蜱的有效途径。本文做了如下研究,从野外长角血蜱僵尸体内分离得到一株绿僵菌,应用形态学、分子生物学方法进行了鉴定并命名为MaLS01;通过对青海血蜱的毒力筛选实验,以期获得高毒力优良菌株,探讨不同寄主的菌株致病性差异;系统研究了该分离株的培养特性、与常规生物杀虫剂的相容性、最佳固体培养条件,为在青海血蜱综合防治中有效利用绿僵菌提供理论依据,同时也为寄主与病原物互作关系的研究提供新的例证。主要实验结果如下: 1:绿僵菌菌株的分离、培养和鉴定 采用孢子稀释分离法,从野外长角血蜱成蜱体内进行菌株的分离。取虫尸体表的分生孢子,用无菌水制成孢子悬液,用接种环在PDA平板表面进行划线,于(28±1)℃的培养箱中培养,待长出菌落后,挑取菌落边缘带菌丝的菌落进行菌株的分离,并于斜面培养基上培养保存。观察菌株在PDA培养基上培养性状,光学显微镜下观察和测量分生孢子梗、产孢细胞大小、分生孢子形状及大小等分类特征,并按照Rombach的分类标准初步鉴定分离菌株的分类地位,通过扩增绿僵菌属ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列,进一步确认该分离株为金龟子绿僵菌小孢变种,并命名为MaLS01。 2:青海血蜱高毒力菌株的筛选 应用绿僵菌分离株MaLS01并结合实验室所保存的6株虫生真菌对青海血蜱饱血雌蜱进行室内感染实验。结果显示,当终浓度为1×108孢子/mL时,绿僵菌MaLS01、Ma1、Ma2、Ma3,白僵菌Bb1、Bb2、Bb3 14d的累计死亡率可达80%、66.67%、60.00%、63.33%、55.67%、43.33%、33.33%。其中绿僵菌MaLS01显示了较高的毒力。 3:菌株MaLS01培养特性的研究 通过生物学研究确定了适宜高毒菌株MaLS01营养生长和产孢的培养基及最佳碳氮比,明确了该菌株生长和产孢对温度、酸碱度等培养条件的要求,以及环境条件对分生孢子萌发的影响,确定了该菌株生长发育和繁殖的适宜温度范围。研究结果表明,该菌株在PPDA培养基上生长良好,最适生长温度为30℃、pH值5~9,最适碳氮比在2:0.5~1。结果显示该菌株对环境条件有良好适应性,并具有较强的耐高温能力。 4:菌株MaLS01与常用农药的相溶性测定 以孢子的萌发率为指标,分高、中、低三个浓度测定了5种常用生物农药与菌株MaLS01的相溶性,结果表明阿维毒死蜱与供试菌株具有较好的相溶性,12小时孢子萌发率分别为85.29%、90.00%、96.44%。 5:菌株MaLS01固体发酵研究 选用大米、麸皮、谷糠、苜蓿、玉米粉为原料,改变各成分的比例,设计了A、B、C、D、E、F六种固体培养基,以产孢量和孢子萌发率为指标进行筛选,结果表明培养基F在产孢量和孢子萌发率上具有一定优势,可以作为菌株MaLS01的固体发酵用培养基。


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