收藏本站
收藏 | 论文排版

稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑敏感性检测及农杆菌介导的稻瘟菌转化—致病缺陷突变体筛选

方敏彦  
【摘要】: 稻瘟病是水稻生产上的重要病害之一,病原菌为Magnaporthe grisea。本研究首先利用菌丝生长速率法,测定了采自广西、桂州、浙江、安徽、福建、江苏、广东省不同地区的53个稻瘟病菌菌株对三唑类杀菌剂丙环唑的敏感性,确定了稻瘟菌对丙环唑的敏感基线。为今后水稻田间抗药性监测提供了依据。同时测定了这53个稻瘟病菌菌株对丙环唑和其它杀菌剂的交互抗性。研究中还发现了2个对丙环唑超敏感的菌株,并对其超敏感现象的分子机理做了进一步的研究。 此外,本研究还利用农杆菌介导的ATMT转化技术筛选出稻瘟菌致病缺陷突变体Fy-1230,从中鉴定了T-DNA插入标记的基因MGG_09926,并对MGG_09926基因在调控稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖和致病性等方面的重要作用进行了研究。 一、水稻稻瘟菌对丙环唑的敏感性及与其它杀菌剂的交互抗性 (一)稻瘟菌对丙环唑的敏感性 供试的53个稻瘟病菌菌株对三唑类杀菌剂丙环唑的EC50值在0.145 ~1.446μg·mL-1之间,平均值为0.901μg·mL-1。将这些菌株的EC50平均值0.901μg·mL-1作为稻瘟病菌对丙环唑的敏感基线。发现菌株2004-006、07-82比其它51个菌株的EC50值小6倍以上(P 0.01)差异极显著,因此将菌株2004-006、07-82视为对丙环唑超敏感菌株,其它菌株为对丙环唑普通敏感菌株。 (二)稻瘟菌对多菌灵、三唑酮的敏感性 所有测试的菌株对三唑类杀菌剂三唑酮的抑制中浓度EC50值在0.533~8.150μg·mL-1之间,超敏感菌株07-82、2004-006对三唑酮的EC50值比其它51个菌株的EC50值小7.5倍以上(P 0.01)差异极显著。53个菌株对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的抑制中浓度EC50值在0.137~0.314μg·mL-1之间,超敏感菌株07-82、2004-006对多菌灵的敏感性与其它普通菌株相似,并没有明显差异,说明超敏感菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂表现出超敏感性。稻瘟菌对丙环唑的EC50与稻瘟菌对多菌灵的EC50相关性分析表明:稻瘟菌对丙环唑与稻瘟菌对多菌灵的敏感性之间不具交互作用。 二、水稻稻瘟菌对三唑类杀菌剂超敏感性的分子机理 (一)超敏感菌株与普通菌株遗传背景分析 利用M13引物PCR指纹分析法对53个稻瘟病菌菌株基因组DNA进行PCR扩增。结果显示:超敏感菌株2004-006与其它菌株扩增出的条带有很大差异,但超敏感菌株07-82得出的条带与其它菌株条带具有很大的相似性,遗传背景一致。说明菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂的超敏感现象不是由遗传背景的差异引起的。 (二)CYP51基因序列分析 三唑类杀菌剂的靶标位点为CYP51(甾醇14- a-脱甲基酶或P45014DM),对CYP51基因序列分析发现,超敏感菌株07-82、2004-006的CYP51基因较普通菌株的CYP51基因分别发生了234、450位氨基酸序列改变。故由此推断这种氨基酸序列改变是引起稻瘟菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂超敏感的原因之一。 (三)CYP51基因表达量分析 分别提取超敏感菌株07-82、2004-006的RNA,mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行real-time PCR扩增,分析不同菌株CYP51基因表达量的差异。结果显示:超敏感菌株07-82、2004-006,普通菌株07-95、07-110的CYP51基因表达量的差异不明显(P 0.05)。说明菌株07-82、2004-006对丙环唑的超敏感现象不是由CYP51基因表达量的差异引起的。 三、稻瘟菌致病缺陷突变体的获得及T-DNA标记基因的鉴定 (一)致病缺陷突变体 利用农杆菌介导转化法(ATMT)筛选出一个对大麦和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突变体Fy-1230。Fy-1230产孢显著下降,在正常的疏水表面不形成附着胞,菌落生长速率明显减慢,菌落颜色比野生型Guy11菌株的浅,有性生殖不能形成子囊壳。 (二)T-DNA标记基因的鉴定 采用hiTAIL-PCR的方法,扩增了T-DNA右边界的1000bp左右的基因组DNA序列并克隆到pGEM-Teasy载体上。测序和BLAST分析结果显示,外源T-DNA插入了稻瘟病菌的MGG_09926基因内,该基因编码507个氨基酸。T-DNA插入位点距基因起始密码子751bp处。在NCBI上BLAST搜索得到与其高度同源性的氨基酸序列,与柄孢霉(Podospora anserina)的XP_001908619序列有93%的相似性,与脉胞菌(Neurospora crassa)的XP_958320序列、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的XP_381455序列都有90%的相似性。 四、突变体Fy-1230 T-DNA单拷贝插入验证 (一)单孢分离后潮霉素抗性检测 将Fy-1230突变体子囊孢子单孢分离,所得到的30个单孢菌落接种到含有潮霉素的培养基上,16个菌落对潮霉素具有抗性,14个菌落对潮霉素不具有抗性,比例接近1∶1。测定结果表明:T-DNA是单拷贝插入的。 (二)单孢菌落的致病性检测 30个子囊孢子菌落所产生的分生孢子点滴接种于离体大麦叶片。16个不抗潮霉素菌落收集的分生孢子悬浮液接种大麦叶片,接种部位发病;14个抗潮霉素菌落收集的分生孢子悬浮液接种大麦叶片,接种部位不发病,不发病与发病比例接近1:1。实验结果表明:这个致病基因单拷贝存在于突变体基因组中。 五、Fy-1230突变体互补载体构建 为了验证突变体Fy-1230的性状改变是由T-DNA插入MGG_09926基因引起的,构建了含有MGG_09926基因和绿色荧光蛋白基因GFP的融合载体Mg-GFP。设计引物扩增GFP基因和MGG_09926基因,得到的两个片段做连接反应,转化克隆,即得到互补载体Mg-GFP。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 柯仿钢;;为什么稻农常说稻瘟病难防治[J];农药市场信息;2011年18期
2 翟焕趁;王宝华;鲁国东;朱立煌;王宗华;;稻瘟病菌无毒基因Avr-Pid2的分子标记及其连锁图[J];热带作物学报;2011年06期
3 姜于兰;谭萍;向红琼;;贵州省稻瘟病菌遗传谱系与生理小种关系[J];湖北农业科学;2011年12期
4 刘永锋;陈志谊;俞文渊;于俊杰;胡建坤;刘邮洲;聂亚锋;;稻瘟病菌分泌蛋白质在致病过程中的作用初探[J];中国水稻科学;2011年04期
5 刘文平;温嘉伟;林秀峰;林春晶;王继春;王嘉琦;王海;;抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究[J];安徽农业科学;2011年22期
6 张月;张学强;王素茹;;苯醚甲环唑和丙环唑对罗非鱼的急性毒性研究[J];现代农药;2011年04期
7 林雄杰;周洁;王宗华;鲁国东;;稻瘟病菌几丁质结合蛋白的生物信息学分析[J];中国农学通报;2011年21期
8 贾书娟;曾大兴;吴小丽;涂国全;;枯草芽孢杆菌C-D6抗菌蛋白对稻瘟病菌的抑菌作用[J];中国生物防治学报;2011年03期
9 刘林;李成云;杨静;苏源;吴晗;徐玲;胡燕玲;;稻瘟病菌ABC转运蛋白基因中SSR的分布及其功能预测[J];植物病理学报;2011年04期
10 杨豪;任春梅;陈毓苓;范永坚;程兆榜;周益军;;2007-2008年江苏省稻瘟病菌遗传多样性[J];华北农学报;2011年04期
11 李进斌;杨静;刘林;何汉明;何霞红;朱有勇;李成云;;云南省稻瘟病菌无毒基因的地理分布(英文)[J];Journal of Resources and Ecology;2011年02期
12 张仁;王缉成;姚源琼;;喷施宝对提高水稻稻瘟病的抗性探讨[J];福建稻麦科技;2011年02期
13 兰波;李湘民;罗山峰;余春华;;30%二烯丙基三硫乳油对稻瘟病菌的抑制作用及田间药效[J];江西农业学报;2011年06期
14 李楠;陈巧玲;李亚娟;郭海滨;罗玉容;;抗稻瘟病细胞突变体筛选技术的研究进展[J];中国农学通报;2011年18期
15 厉晓东;卢建平;刘小红;林福呈;;稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测[J];植物病理学报;2011年04期
16 毛羽;;水稻稻瘟病的症状及防治措施[J];养殖技术顾问;2011年08期
17 张芬;刘邮洲;于俊杰;聂亚锋;陆凡;刘永锋;;水稻稻瘟病菌拮抗细菌的筛选与鉴定[J];江苏农业学报;2011年03期
18 曾凡松;向礼波;杨立军;杨小林;杨金松;喻大昭;;251份水稻品种(系)对稻瘟病的抗性鉴定及抗性多样性分析[J];植物病理学报;2011年04期
19 杨共强;宋玉立;何文兰;孙静;;几种杀菌剂对小麦白粉病的防治效果[J];河南农业科学;2011年08期
20 李晓文;马星霞;蒋明亮;;戊唑醇和丙环唑的耐腐性能评价[J];木材工业;2011年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 何月秋;唐文华;HeiLeungRobertS.Zeigler;;稻瘟病菌致病突变株的分离[A];中国植病学会西南联合学术年会论文集[C];2000年
2 彭友良;杨俊;王维香;赵晓燕;许金荣;王大伟;孙静;;RNA剪切体组分作为稻瘟病菌的一类新致病因子[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
3 杨俊;王维香;赵文生;孔令安;孙静;薛敏峰;陈小林;王大伟;王瑞金;王立霞;张燕;许金荣;彭友良;;Con2作为剪切体的新成员控制稻瘟病菌的致病性和分生孢子产生[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
4 卢建平;刘同宝;刘小红;林福呈;;稻瘟病菌基因组学的研究[A];2003’华东植物病理学术研讨会暨江苏省植物病理学会第十次会员代表大会论文集[C];2003年
5 方峰;李盾;张明;;稻瘟病菌抗药性研究概况[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
6 张海峰;赵倩;张幸;张正光;王源超;郑小波;;稻瘟病菌磷酸二酯酶基因的功能研究[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
7 穆常青;刘雪;潘玮;陆庆光;蒋细良;朱昌雄;;枯草芽孢杆菌B-332菌株对稻瘟病的防治效果及定殖作用研究[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
8 刘永锋;俞文渊;陈志谊;刘邮洲;聂亚锋;于俊杰;;水稻稻瘟病菌孢子萌发特性及其分泌蛋白质研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
9 刘娟;周益军;范永坚;;稻瘟病菌无毒基因的分子标记[A];中国植物病理学会第六届青年学术研讨会论文集——植物病理学研究进展(第五卷)[C];2003年
10 郑小波;张正光;;稻瘟病菌无性重组研究[A];中国植病学会西南联合学术年会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 方敏彦;稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑敏感性检测及农杆菌介导的稻瘟菌转化—致病缺陷突变体筛选[D];甘肃农业大学;2009年
2 徐飞;基于结构的对于水稻和稻瘟病菌相互作用所包含蛋白的计算研究[D];浙江大学;2009年
3 张海峰;稻瘟病菌G蛋白及MAPK信号途径相关基因的功能分析[D];南京农业大学;2011年
4 李宏宇;稻瘟病菌T-DNA插入突变研究[D];福建农林大学;2003年
5 刘同宝;稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG4表达模式与功能分析[D];浙江大学;2008年
6 翟焕趁;稻瘟病菌菌株FJ81278无毒基因Avr-Pid2的定位及深度测序分析[D];福建农林大学;2011年
7 刘二明;水稻品种与稻瘟病菌的遗传多样性及稻瘟病持续控制研究[D];四川农业大学;2001年
8 林雄杰;稻瘟病菌Rab5互作蛋白研究[D];福建农林大学;2011年
9 陆凡;江苏省稻瘟病菌遗传多样性研究[D];南京农业大学;2000年
10 王教瑜;稻瘟病菌MGTA1基因的克隆与功能分析[D];浙江大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 姜凯;水稻纹枯病及稻瘟病拮抗菌的分离与抗性成分分析[D];四川农业大学;2010年
2 杨帆;稻瘟病菌Rho2同源蛋白的功能分析[D];福建农林大学;2010年
3 陈春南;稻瘟病菌81278ZB15 BAC克隆子805L15中7个假定分泌蛋白的功能分析[D];福建农林大学;2010年
4 赵玉峰;一株稻瘟病拮抗菌株的筛选、诱变育种及抗菌谱测定[D];河南工业大学;2010年
5 林成增;稻瘟病菌假定几丁质酶基因功能分析[D];福建农林大学;2010年
6 刘小红;利用启动子陷阱技术(Promoter trapping)构建稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)突变体库[D];浙江大学;2004年
7 金鑫;稻瘟病生防菌Af1、Af4的初步研究[D];华中农业大学;2010年
8 王红;稻瘟病菌亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MoMET13)功能的初步研究[D];浙江大学;2011年
9 刘娟;稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)致病相关基因的分子标记及克隆[D];南京农业大学;2003年
10 高立宏;稻瘟病菌粗毒素对水稻组织培养的影响及抗性突变体筛选[D];吉林农业大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 水清;丙环唑防治水稻纹枯病适宜用量[N];江苏农业科技报;2009年
2 冯国明;近年稻瘟病为何高发[N];湖南科技报;2007年
3 本报记者 卢育辉 梁少棉;我省攻克稻瘟病世界性难题[N];广东科技报;2006年
4 刘在军;引进推广抗病新品种是首选[N];白银日报;2007年
5 张润辛 杨娜;春季果树病虫的防治[N];陕西科技报;2006年
6 张润辛 刘小峰;春季梨树病虫的防治[N];陕西科技报;2006年
7 ;美国制定丙环唑最大残留限量法规[N];中国国门时报;2007年
8 姜书凯;炔草酸等三个农药新产品通过鉴定[N];农资导报;2008年
9 水清;防治穗颈瘟,水稻破口期用药是关键[N];江苏农业科技报;2008年
10 省农科院植保所 陈志谊;水稻三大病害抗性育种有待加强[N];江苏农业科技报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978