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《西北师范大学》 2007年
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荒漠藻胞外聚合物抗肿瘤机制的研究

张宏  
【摘要】: 研究表明,荒漠藻胞外聚合物(extracelluar polymeric substances,EPS)在其适应强辐射胁迫,温度胁迫和水分胁迫方面起着重要作用,同时在荒漠地区生物结皮形成中扮演着不可替代的生态学功能。然而,有关EPSs抗肿瘤方面的生物活性在国内外尚未见报道。本研究从EPSs对体外培养的人表皮癌细胞系(A431)存活率的影响,细胞的形态学变化,细胞DNA受损情况方面探索了EPSs的抗肿瘤活性;从细胞抗氧化系统失调,细胞凋亡相关基因表达改变等方面研究了EPSs抗肿瘤的可能机制。具体研究内容与结果如下: (1)采用MTT法检测EPSs对A431细胞存活力的影响,通过Bliss法计算5种藻胞外聚合物作用于A431细胞96h的半抑制浓度(InhibitoryConcentration,IC_(50))分别为:EPS-M(EPS-M.vaginatus),2.75mg/mL;EPS-N(EPS-Nostoc sp.),5.32mg/mL;EPS-D(EPS-D.olvaceus),4.68mg/mL;EPS-P(EPS-P.tenue),9.44mg/mL;EPS-S(EPS-S.javanicum),4.25mg/mL。虽然五种藻的胞外聚合物对A431细胞都有较强的生长抑制作用,但不同来源的EPSs作用效果存在着一定的种属差异,这可能与不同藻的胞外聚合物的组成成分、糖链构象间差异有关。 (2)采用HE染色,AO/EB染色和Giemsa染色3种方法观察细胞的形态学变化。实验结果表明形态学上出现了典型的细胞凋亡形态。HE染色从总体上观察了A431细胞的凋亡。AO/EB染色区分了凋亡细胞和坏死细胞,而Giemsa染色则清楚的显示核结构的变化。结果提示EPSs诱导了A431细胞凋亡。 (3)采用彗星电泳法检测DNA受损情况,各EPSs实验组电泳的结果都出现明显的彗尾。利用CASP分析软件分析彗尾长度和彗星细胞所占的比例,各实验组与对照组相比,差异均为显著(p<0.05)。其中以EPS-M和EPS-S的作用最为明显,彗星细胞率分别达到77.8%和76.2%。结果提示EPS造成了A431细胞内DNA不同程度的损伤。 (4)采用化学比色法检测EPSs作用于A431细胞不同时间后,细胞内抗氧化系统酶类的活性(superoxide dismutase,SOD;glutathione peroxidases,GPX),小分子抗氧化剂(reduced glutathione,GSH)以及脂质过氧化产物MDA(Malondialdehyde)含量的变化。结果显示,细胞内的SOD和GPX的活性均出现先升高后降低的变化趋势,GSH的含量也出现类似的变化趋势,MDA的含量则随作用时间的延长而逐渐增加。结果提示EPSs的作用破坏A431细胞内的抗氧化系统的平衡,将细胞内抗氧化酶类和小分子抗氧化剂消耗殆尽,使细胞无法再进行自我防御,进而导致细胞凋亡的启动。 (5)采用蛋白质印迹(Western Blotting)检测了Caspase-3和Caspase-9的表达。研究结果显示,EPSs的作用上调了Caspase-3和Caspase-9的表达,使Pro-caspase-3被剪接而激活,并且这种激活作用呈现出剂量依赖型效应,但各实验组间也有所不同,其中EPS-M和EPS-D实验组作用效果较为明显。Caspase-9表达的上调,在EPS-M和EPS-D实验组中不随着作用浓度的增大而上升,而是在2mg/mL时上调作用最为明显,而后随作用浓度的增加逐渐减弱,而EPS-N,EPS-P,EPS-S实验组的Caspase-9表达的上调则出现与剂量成正比关系。正是由于caspase-9酶原的激活导致了凋亡执行因子caspase-3酶原的激活,进而激活了细胞凋亡的线粒体途径。 (6)采用免疫组织化学法(immunohistochemical staining,IHC)检测了Caspase-3,Bax和Bcl-2的表达。EPSs的作用上调Caspase-3和Bax的表达而下调Bcl-2的表达,EPS-M对Caspase-3表达上调作用最为明显,阳性率达到81.2±5.16%;EPS-S对Bax表达上调作用最为显著,阳性率达到86.5±13.05%;而在抑制Bcl-2过表达中,EPS-S的作用最为明显,阳性率从72.6±6.45%下降到6.5±1.67%,这些结果与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。实验结果提示EPSs的作用改变了凋亡相关基因Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达,启动了细胞凋亡的线粒体途径。 总上所述,本研究从A431细胞存活率,形态学变化,DNA受损情况方面充分说明了EPSs的抗肿瘤活性。利用蛋白质印迹技术和免疫组织化学染色法检测了凋亡相关基因Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达变化,证明诱导细胞凋亡是EPSs抗肿瘤机制之一,并且激活细胞凋亡的线粒体途径。此外,EPSs的作用引起细胞内氧化/抗氧化系统失调是其诱导细胞凋亡另一条可能途径。
【学位授予单位】:西北师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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