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DNA分子荧光探针的研究

郑秀荣  
【摘要】: 脱氧核糖核酸(DNA)是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基础,它在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动中起着非常重要的作用。DNA分子的定量分析、特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。定量测定是研究DNA的基础,但由于DNA的内源荧光很弱,直接利用其荧光测定受到限制。溴化乙锭(EB)是应用最早也是应用最广的荧光探针,不仅可用于核酸的定性定量分析,也可以用于研究核酸杂交动力学特性,但由于溴化乙锭的致癌性,使它的进一步应用受到很大的挑战,人们开始寻找新的探针。目前人们对这方面做了很多的工作,而高灵敏的DNA生物探针的合成与应用,同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研究的热点。 本人在前人的研究基础上做了一些工作,在DNA分子探针方面有了一些研究进展,本论文主要包括以下四部分的内容: 第一部分,以中药小檗碱(berberine)作为荧光探针,在0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲体系中,用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色谱等方法研究了贵金属离子Ru(Ⅲ)、Rh(Ⅲ)、Pd(Ⅱ)与ct-DNA的键合相互作用。实验发现,在三种贵金属离子中,Pd(Ⅱ)对小檗碱-DNA体系的荧光有较强的猝灭作用,而Ru(Ⅲ)和Rh(Ⅲ)对该体系产生强烈的荧光敏化作用。分别求出了三种贵金属离子与DNA的结合常数。三种贵金属离子与DNA结合能力的强弱顺序依次为:Ru(Ⅲ)>Rh(Ⅲ)>Pd(Ⅱ)。探讨了三种贵金属离子与DNA的作用机理及导致结合力不同的原因。 第二部分,利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶电泳等方法系统比较了小檗碱和溴化乙锭与ct-DNA的光谱学作用。在ct-DNA存在时,小檗碱和溴化乙锭的荧光强度都有较大的提高(pH=7.01时,C_(DNA)/C_(Ber)=9,F/F_o=60,C_(DNA)/C_(EB)=9,F/F_o=69.5),pH的改变对二者荧光光谱的发射峰位与强度影响不大,紫外-可见吸收光谱随ct-DNA浓度的增加,表现出减色效应(C_(DNA)/C_(Ber)=10,A_o/A=1.2078,C_(DNA)/C_(EB)=0.5,A_o/A=1.2123),二者都使ct-DNA的圆二色谱正负峰的吸收强度有所增加(C_(DNA)/C_(Ber)=60,θ/θ_o=1.228,C_(DNA)/C_(EB)=60,θ/θ_o=1.426),凝胶电泳实验中,EB-DNA体系的发光强度高于berberine -DNA体系,故采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶电泳方法系统比较了小檗碱和溴化乙锭与ct-DNA的键合作用。在DNA的定量测定中,可用无毒副作用的小檗碱代替有致癌性的溴化乙锭,为安全、不造成环境污染定量测定核糖核酸提供了新试剂使用基础,也为寻找更合适的DNA分子荧光探针提供线索。 第三部分,通过改造溴化乙锭合成了苯甲酰基硫脲化合物,并用红外光谱,~1H核磁共振谱,元素分析等方法进行了表征。该化合物有良好的荧光性能。用光谱学方法研究了该化合物与ct-DNA的相互作用。在ct-DNA存在时,化合物的荧光强度增加;紫外-可见吸收光谱随ct-DNA浓度的增加,表现出减色效应;ct-DNA的圆二色谱正峰的吸收强度有所增加,负峰的吸收强度有所减小,故采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱等方法研究了物质与ct-DNA的键合作用。计算出化合物与ct-DNA的表观结合常数K=4,4×10~3L·mol~(-1)。探讨了化合物与ct-DNA的键合作用应该是有嵌入和静电作用两种方式,而主要以嵌入作用为主。 第四部分,合成了O-(硫杂蒽酮-[21-基)-氧乙酸,并用元素分析(elementalanalysis)、红外光谱(m)、~1H核磁共振谱(~-H NMR)和~(13)C核磁共振谱(~(13)C NMR)等方法对其结构进行了表征。实验发现该化合物有良好的荧光性能。用光谱学方法研究了该化合物与ct-DNA的相互作用,结果表明,在pH=7.38的模拟体液条件下,当ct-DNA存在时,该化合物的紫外-可见吸收光谱随ct-DNA浓度的增加,表现出减色效应,该化合物使ct-DNA的圆二色谱正负峰的吸收强度有所降低,该化合物的荧光强度被ct-DNA显著猝灭,猝灭常数为1.25×10~4L/mol,当ct-DNA的浓度在0~12.0 mg/L范围内变化时,荧光猝灭值与ct-DNA的浓度呈现良好的线性关系。该化合物对ct-DNA的检出限为1.63 m/L。据此,O-(硫杂蒽酮-[2]-基)-氧乙酸是一种可用于测定ct-DNA浓度的新试剂。O-(硫杂蒽酮-[2]-基)-氧乙酸与ct-DNA的作用主要有嵌入作用和静电吸引两种方式。


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