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藏羚羊高海拔低氧适应的心脏特征及CaMKⅡδ、ANP、BNP基因的克隆与表达

常荣  
【摘要】:背景和目的:青藏高原平均海拔在4000-5000米,形成了独特的高原气候:大气压低、氧分压低、寒冷干燥、日照时间长,紫外线辐射强。长期以来高原成为人类最具有挑战和研究意义的环境之一,大量已发表的研究都借助“高原”这一特殊地理环境来研究高原低氧对人体的影响以达到对临床医学缺氧问题的理解和治疗。对于高原低氧的适应分为两大类即遗传性适应和获得性习服:高原世居人群如青海藏族人民及高原土著动物如高原鼠兔、藏羚羊、牦牛等经过长期的进化、自然选择形成了对高原低氧环境的遗传性适应,该适应是非可逆、可遗传的形态结构、生理生化方面的改变过程。它是高原土生动物和高原世居人群世代在低氧环境中生存、进化的结果,是机体克服低氧环境得以生存的有效途径。低氧适应的本质就是在低氧条件下机体能够最大限度地摄取和利用有限的氧,完成正常的生理功能,是人类或动物在高原生活数千至数万年而自然选择所获得的适应,具有遗传学基础。健康人或动物到达高原后通过一系列的生理性调节逐步达到的适应属获得性习服。不论是获得性习服还是遗传性适应均建立起与高原低氧环境的适应以维持正常的生命过程。而一些移居生物如果没有形成有效的适应性机制,则表现出一系列生理、生化等水平的改变,严重者出现慢性高原病。 由于高原土著动物的极佳适应能力,成为研究高原低氧适应的最佳动物模型,研究者期望通过对这些动物的研究能够更好的理解急慢性高原病发病机制,以预防治疗急慢性高原病。前期对高原土著动物的研究发现:在生理水平表现低氧通气反应钝化、红细胞、血红蛋白不升高,肺动脉压无增高,无右心室肥厚的表现;在形态学水平表现为肺小动脉壁薄,缺乏平滑肌层,心肌骨骼肌细胞线粒体含量丰富;在分子水平成功克隆低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF-1a)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),肌红蛋白(Myoglobin,MGB),脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)、血红蛋白(Haemoglobin, Hb)、线粒体环氧化酶等低氧相关基因,并发现高原土著动物组织中HIF-1a表达升高,同时一些低氧相关基因有其特殊的结构。心脏和血管是实现血液循环的基础,有效血液循环的维持对机体组织与器官的氧、营养物质的供应有重要作用。有效的血液循环依赖于心脏的收缩与舒张来完成,钙离子是心肌兴奋收缩耦联的关键因子,而钙调素和钙/钙调素依赖的蛋白激酶IIδ亚单位(calcium/ calmodulin- dependent protein kinase II delta,CaMKⅡδ)通过调节钙离子在细胞内的稳态在心肌的收缩舒张过程中具有关键作用。心房利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP)与脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)属于利钠肽系统,是心血管系统分泌的肽类,这一系统的物质具有利尿、利钠、扩血管作用,并通过旁分泌/自分泌的的方式抑制心肌细胞肥大,减缓心室重构,在一些病理条件下发挥重要代偿作。ANP、BNP基因表达的增加与血清分泌的增多与心肌生长、体育运动及心功能紊乱有关,是临床上心肌肥厚、心力衰竭有用的标记物。在对心肌生理性肥厚及病理性肥厚ANP、BNP基因表达的研究中发现,生理性肥厚时ANP较正常心肌组表达增高,但较病理性肥厚低,BNP在心肌正常组及生理性肥厚中的表达均无明显升高,但在心功能失代偿期时表达明显增高。最近研究发现CaMKⅡ在ANP与BNP的分泌中具有共同的调控作用。目前在已发表的文献中,对于高原土著动物心肌收缩力以及CaMKⅡδ、ANP、BNP等与心脏形态、收缩功能相关基因的研究尚未看到报道。藏羚羊(Tibetan antelope)隶属偶蹄目,牛科,羚羊亚科,藏羚属,它系青藏高原特有种,主要生活在青藏高原一带,栖息于海拔3700米到5500米的高山草原、高原荒漠上,在高海拔、严重缺氧的环境中,具有极强的运动能力和低氧耐受能力。藏系绵羊(Tibetan sheep)又称藏系羊,属偶蹄目,牛科,绵羊属,是我国三大原始绵羊品种之一。主要分布在青藏高原,青海是主要产区,一般生活在海拔3000m以上,是长期自然和人工培育选择下形成的一个地方品种。本课题首次研究藏羚羊的心脏形态及左心室收缩功能特征及心脏形态、收缩功能相关的基因(CaMKⅡδ、ANP、BNP),并与同一海拔的藏系绵羊进行比较,了解藏羚羊心脏适应慢性低氧的特点,旨在探讨高原缺氧环境下遗传性适应及获得性习服条件下的心脏适应的分子生物学机制及在不同低氧应激下心脏左心室收缩功能的适应性变化。 方法和技术路线:经国家林业局批准(林护许准[2009]46号) ,2009年4月在青海省可可西里国家级自然保护区(海拔4300米)捕获雄性藏羚羊9只,雄性藏系绵羊10只,捕捉后立即运至格尔木市(海拔2800米,氧浓度为21.1%)实验基地进行实验。动物捕捉后用盐酸噻拉唑注射液按1-5mg/kg肌注麻醉,麻醉后固定,经左颈总动脉插入心导管至左心室并固定导管,用MAP100多导生理(美国BIOPAC公司)记录仪测定心率(Heart Rate,HR)、收缩压(Systolic Blood Pressure ,SBP)、舒张压(Diastolic Blood Pressure DBP)、左室等容收缩期心室内压力上升最大速率和左室等容舒张期心室内压力下降最大速率(the maximum rate of the ventricular pressure rise/lower,±dp/dt)。以格尔木市的氧浓度(21.1%)为基线,分别给予更低氧浓度14.6%、12.5% (分别相当于海拔5300米、6300米)的低氧吸入15分钟后重复测定以上指标。血流动力学指标测定结束后,取5只藏羚羊,10只藏系绵羊心脏,测定二者的心脏/体重比(the ratio of heart weight to body weight,HW/BW)、右心室/(左心室+室间隔)重量比[the ratio of right ventricle to left ventricle plus septum weights,RV/(LV+IVS)]。测定完上述指标后,迅速将心肌组织剪碎,一部分投入液氮容器,为分子实验备用,另一部分放入2.5%戊二醛固定,为形态学实验备用。用日本产JEM-1230型透射电镜观察心肌细胞线粒体数目及形态。应用软件Primer5设计藏羚羊、藏系绵羊基因CaMKⅡδ、ANP、BNP、GAPDH的引物,应用RT-PCR技术克隆以上基因的部分序列,获得GeneBank确认后进行Real Time PCR技术研究CaMKⅡδ、ANP、BNP的基因表达。实验数据用SPSS 13.0统计软件处理,首先行正态性检验,资料均为正态或近似正态分布,藏羚羊、藏系绵羊HW/BW、RV/(LV+IVS)及同一氧浓度下HR、SBP、DBP、±dp/dt、+dp/dt变化率等指标的显著性检验采用独立样本t检验,三种吸入氧浓度下(Fio2分别为:21.1%、14.6%、12.5%)藏羚羊、藏系绵羊的SBP、DBP、±dp/dt的显著性检验采用方差分析,两两比较采用LSD检验,数据表示以均数±标准差(±s)表示,检验水准为α=0.05。 研究结果: (1)藏羚羊、藏系绵羊心脏形态学研究:藏羚羊HW/BW(8.38±0.30%)显著大于藏系绵羊(4.84±0.52%)(P0.001),藏羚羊RV/(LV+IVS)(0.34±0.02%)与藏系绵羊(0.36±0.05%)无统计学意义。心肌超微结构电镜下观察:放大6000倍电镜观察藏羚羊心肌细胞中线粒体数目较藏系绵羊明显增多,放大40000倍电镜观察两种动物的线粒体结构完整,但藏羚羊线粒体体积较大,藏羚羊线粒体嵴排列紧密,粒体嵴数量明显增多。 (2)藏羚羊、藏系绵羊血流动力学研究:以实验基地格尔木市(Fio2:21.1%)为基线水平。基础状态下藏羚羊HR(26.33±6.15次/分)SBP(97.75±9.56 mmHg)DBP(69.53±7.55 mmHg)较藏系绵羊HR(34.20±6.57次/分)SBP(130.06±17.79 mmHg)DBP(91.70±13.58 mmHg)显著降低(P0.05),藏羚羊±dp/dt(633.87±159.49mmHg/s,-396.93±166.68mmHg/s)较藏系绵羊(564.76±229.03 mmHg/s,-259.82±124.21mmHg/s)无显著差异。藏羚羊分别吸入氧浓度为14.6%,12.5(%分别相当于海拔5300米、6300米)的低氧后+dp/dt随氧浓度降低明显升高,并具有显著性差异(P0.05),但14.6%和12.5%的氧浓度两组之间的血液动力学差异无显著性,SBP、DBP、-dp/dt没有明显变化,无显著差异。藏系绵羊分别吸入氧浓度为14.6%,12.5%的低氧后,SBP、DBP以及+dp/dt降低明显,并具有显著性差异(P0.05);但14.6%和12.5 %的氧浓度两组之间差异无显著性,-dp/dt在吸入不同氧浓度各组间均没有显著差异。同一吸入氧浓度下(14.6%,12.5%)藏羚羊的SBP、±dp/dt均高于藏系绵羊,有统计学意义。进一步以实验基地格尔木市(海拔4300米)的氧浓度(21.1%)为基线(100%),计算吸入低氧后+dp/dt的变化率,藏羚羊+dp/dt分别升高至145.1%和148.1%,而藏系绵羊分别降低至68.4%和70.5%(P0.05)。 (3)藏羚羊、藏系绵羊心肌收缩及肥厚相关基因研究:克隆CaMKⅡδ、ANP、BNP、GAPDH等四个基因,显示藏羚羊、藏系绵羊的CaMKⅡδ基因编码区部分序列与GeneBank中的牛、人的基因的同源性在90%以上;藏羚羊、藏系绵羊的ANP基因编码区部分序列与牛、羊的序列同源性在95%以上;藏羚羊、藏系绵羊的BNP基因编码区部分序列与人、鼠的序列同源性在50%左右;藏羚羊GAPDH基因编码区部分序列与牛、人、鼠的序列同源性在90%以上;藏系绵羊GAPDH基因编码区部分序列与牛、人、鼠的序列同源性在85%以上;藏羚羊、藏系绵羊之间CaMKⅡδ、ANP、BNP、GAPDH基因的同源性均在97%以上。将以上基因提交至GeneBank后获得确认,序列号如下:CaMKⅡδ(藏羚羊: HQ230328,藏系绵羊: HQ449191), ANP (藏羚羊: HQ449188,藏系绵羊: HQ449190), BNP (藏羚羊: HQ449187,藏系绵羊: HQ449189),GAPDH (藏羚羊: HQ625519,藏系绵羊: HQ625518),表明本实验克隆上述基因部分序列成功。应用经确认后的基因引物行实时定量PCR测定结果显示:藏羚羊左心室CaMKⅡδ(1.347±0.219)、ANP(1.057±0.175)表达较藏系绵羊CaMKⅡδ(0.545±0.002)、ANP(0.436±0.161)显著增高(P 0.05),而藏羚羊左心室BNP(1.554±0.134)表达较藏系绵羊的表达(1.127±0.357)没有明显差异。 结论:藏羚羊经过长期的自然选择其心脏对高海拔低氧环境的适应具有以下特点: 1.藏羚羊具有生理性心肌肥厚的特点,是通过增加心脏器官的重量,而没有表现右心室肥厚来适应高海拔低氧环境,这与藏羚羊较强的运动能力及较强的心肌收缩力有关。 2.其心肌收缩功能的适应性特征为:在静息状态下以较低的心率、血压及左心室心肌收缩力来降低氧耗量以此适应高原低氧环境,而以海拔更高的较低氧浓度为应激条件下,左心室心肌收缩力明显升高,以增加氧运输至组织的能力。 3.藏羚羊心肌细胞中线粒体数目较藏系绵羊明显增多,线粒体体积较大,线粒体嵴排列紧密,粒体嵴数量明显增多从而增加心肌摄取氧和产生ATP的能力,同时线粒体数量的增多与藏羚羊心脏重量增加呈一定的相关性。 4.成功克隆了藏羚羊、藏系绵羊的CaMKⅡδ、ANP、BNP、GAPDH等基因的部分序列,发现藏羚羊、藏系绵羊间基因的同源性较高,CaMKⅡδ、ANP、GAPDH基因与牛、羊的同源性较接近。以上四种基因提交至GeneBank后获得确认及序列号。这为以后相关基因的研究提供了序列依据。 5.藏羚羊CaMKⅡδ表达增高,同时通过CaMKⅡδ途径使心肌肥厚的标记物ANP表达上调,而作为心力衰竭的标记物:BNP无明显升高,提示藏羚羊心肌肥厚及低氧应激下左心室心肌收缩力增加可能与CaMKⅡδ基因表达增高有关。而BNP基因水平无明显增高,提示藏羚羊的心肌肥厚是长期缺氧环境下为适应低氧的生理性肥厚,是增加心肌收缩力的代偿性反应。 以上特点提示:藏羚羊作为高原适应性动物,经过漫长的自然选择其心脏对高原低氧环境的形成了遗传性适应,这不同于生活在同一海拔的藏系绵羊,后者在更低的缺氧环境下即表现出了生理上的失代偿,在基因水平表现出了不适应,其心脏对高海拔低氧环境的适应可能为获得性习服。


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