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《青海大学》 2017年
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水母雪莲表皮毛发育相关基因SmTTG1的遗传转化研究

胡学敏  
【摘要】:水母雪莲(Saussurea medusa Maxim),又称水母雪兔子,属菊科风毛菊属,是一种生长于青藏高原地区的珍稀、濒危药用植物。同时,它又是一种典型的高山植物。植株密被表皮毛是水母雪莲最具有代表性的形态特征,它是水母雪莲对极端环境的一种适应结构。研究水母雪莲表皮毛的形成和发育过程,对揭示高山植物适应环境的特殊机制将具有重要的理论意义。为此,本研究以水母雪莲作为实验材料,以表皮毛发育相关基因SmTTG1为研究对象,构建了SmTTG1基因的植物表达载体,通过根癌农杆菌为介导,转入普通烟草中。主要研究结果如下:(1)根据本实验室已克隆得到的水母雪莲SmTTG1基因序列(Genbank登陆号:KX447632),在其CDS两侧分别设计上下游引物,在上游引物5′端加入酶切位点SalⅠ,在下游引物5′端加入酶切位点Bam HⅠ,克隆了水母雪莲SmTTG1基因的CDS序列(含酶切位点)。(2)通过酶切法,将目的基因SmTTG1插入质粒pRI 101-AN DNA的多克隆位点,构建了植物表达载体pRI 101-AN-SmTTG1,并通过冻融法将其导入农杆菌C58C1中。(3)在根癌农杆菌介导下,通过叶盘法将目的基因SmTTG1转入普通烟草中。通过PCR和RT-PCR检测,获得8株转基因烟草植株。形态学比较表明,转基因烟草植株与对照植株无明显差异,说明SmTTG1基因过量表达不一定对烟草的形态产生影响。
【关键词】:水母雪莲 表皮毛 SmTTG1基因 植物表达载体 遗传转化
【学位授予单位】:青海大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S567.239;Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-5
  • Abstract5-9
  • 主要符号对照表9-10
  • 第1章 引言10-20
  • 1 表皮毛研究进展10-12
  • 1.1 表皮毛的定义10
  • 1.2 表皮毛的功能10-11
  • 1.3 表皮毛发育的调控基因11-12
  • 2 TTG1基因12-14
  • 2.1 TTG1基因的功能12
  • 2.2 TTG1基因编码的蛋白12-13
  • 2.3 TTG1基因的研究进展13-14
  • 3 遗传转化14-18
  • 3.1 植物遗传转化的研究进展14-15
  • 3.2 植物遗传转化方法的研究15-17
  • 3.3 转基因植物的验证方法17-18
  • 4 本研究的目的和意义18-20
  • 第2章 表达载体及农杆菌转化体系构建20-42
  • 1 实验材料20-22
  • 1.1 植物材料20
  • 1.2 菌株与质粒载体20
  • 1.3 试剂盒及酶20
  • 1.4 试剂及培养基的配制20-21
  • 1.5 抗生素21
  • 1.6 引物的设计及合成21-22
  • 2 实验方法22-32
  • 2.1 水母雪莲总RNA的提取22-23
  • 2.2 水母雪莲cDNA的合成23-24
  • 2.3 目的基因PCR扩增24-25
  • 2.4 目的片段的回收纯化25
  • 2.5 回收产物的连接与转化25-26
  • 2.6 阳性克隆的检测与测序26-27
  • 2.7 质粒提取27
  • 2.8 质粒DNA的酶切27-28
  • 2.9 目的片段的回收28
  • 2.10 重组质粒pRI101-AN-SmTTG1的构建28-29
  • 2.11 连接产物pRI101-AN-SmTTG1转化大肠杆菌29-30
  • 2.12 pRI101-AN-SmTTG1的检测30-31
  • 2.13 植物表达载体转化农杆菌31-32
  • 3 结果与分析32-39
  • 3.1 水母雪莲SmTTG1基因CDS序列的克隆32-34
  • 3.2 重组质粒pMD- SmTTG1的检测34-36
  • 3.3 植物表达载体构建36-38
  • 3.4 农杆菌中重组质粒pRI101-AN-SmTTG1的菌液PCR检测38-39
  • 4 讨论39-40
  • 5 结论40-42
  • 第3章 SmTTG1基因转化烟草的研究42-56
  • 1 实验材料42-45
  • 1.1 植物材料42
  • 1.2 菌株与质粒载体42
  • 1.3 试剂盒及酶42
  • 1.4 试剂及培养基的配制42-44
  • 1.5 抗生素44
  • 1.6 引物的设计及合成44-45
  • 2 实验方法45-49
  • 2.1 烟草无菌苗的培养45
  • 2.2 受体材料的预培养45
  • 2.3 农杆菌的活化培养45
  • 2.4 农杆菌介导SmTTG1基因的遗传转化45-46
  • 2.5 转基因烟草的检测与鉴定46-49
  • 3 结果与分析49-54
  • 3.1 转基因烟草的获得49-50
  • 3.2 转基因烟草的检测50-54
  • 4 讨论54-55
  • 5 结论55-56
  • 展望56-58
  • 参考文献58-64
  • 致谢64-66
  • 作者简历66

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