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《青海大学》 2017年
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大鼠脑、肝组织RNA相对表达量与死亡时间的关系

董智杰  
【摘要】:目的研究大鼠脑、肝脏组织3种RNA相对表达量与死亡时间(postmortem interval,PMI)的关系,比较两组织用于死亡时间推断的可能性,为RNA在死亡时间推断方面的应用提供理论依据。方法将48只Wistar大鼠随机分为6组,断颈处死后置于海拔2260 m、室温12±1℃、湿度40±2%的环境中,分别于死后0 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h取大鼠脑皮质及肝右外叶。将一部分脑和肝组织用4%多聚甲醛固定后进行HE染色制片观察。另一部分脑、肝组织提取总RNA,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)技术检测两组织中miRNA(脑特异性miR-124、肝特异性miR-122)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)m RNA的循环阈值(cyclic threshold,Ct)。用Best Keeper程序筛选内参,对目的RNA的Ct值进行2~(-ΔΔCt)转换,用SPSS及Graph Pad软件对其进行单因素方差分析;并对ΔCt值进行曲线回归分析,构建回归模型。结果1、脑组织中miR-124的标准差(standard deviation,SD)和变异系数(coefficient of variation,CV)最小,肝组织中miR-122的SD和CV最小。2、脑组织GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2~(-ΔΔCt)在死后72 h内逐渐增加,并于死后72 h达到峰值,之后逐渐下降(P0.05);而肝GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2~(-ΔΔCt)在死后24 h内不变,从死后48 h开始逐渐下降(P0.05)。3、所有目的RNA分子的ΔCt值与PMI的最适回归模型均为三次模型,且肝组织的相关系数r大于脑组织。最适模型的回归方程分别为:y_(脑GAPDH m RNA)=3.280-0.028x+2.343×10~(-4)x~2-5.440×10~(-7)x~3,y_(脑β-actin m RNA)=4.231-0.039x+3.985×10~(-4)x~2-1.103×10~(-6)x~3,y_(肝GAPDH m RNA)=4.965-4.460×10~(-3)x+4.328×10~(-4)x~2-1.666×10~(-6)x~3,y_(肝β-actin m RNA)=5.660-0.019x+6.064×10~(-4)x~2-1.947×10~(-6)x~3。结论1、通过内参筛选,认为miR-124和miR-122可以分别作为脑、肝组织的内参。2、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下,大鼠脑组织中GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2~(-ΔΔCt)在死后72 h内逐渐增加,并在72 h达到高峰,之后逐渐下降;大鼠肝组织中GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2~(-ΔΔCt)在死后24 h内不变,从死后48 h开始逐渐下降,肝组织比脑组织更适用于死亡时间推断。3、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下,大鼠脑、肝组织中GAPDH、β-actin m RNA的ΔCt值与死亡时间的最适回归模型均为三次模型。
【关键词】:mRNA miRNA 相对表达量 死亡时间 RT-qPCR
【学位授予单位】:青海大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:D919.4
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-10
  • 主要符号对照表10-11
  • 整体思路图11-12
  • 第1章 引言12-15
  • 第2章 实验材料与方法15-21
  • 2.1 实验材料15-16
  • 2.1.1 实验动物15
  • 2.1.2 实验试剂15
  • 2.1.3 实验仪器15-16
  • 2.2 实验方法16-20
  • 2.2.1 实验动物分组与处理16
  • 2.2.2 检测方法16-20
  • 2.2.2.1 HE染色16-17
  • 2.2.2.2 总RNA提取17-18
  • 2.2.2.3 RNA浓度、纯度及完整性检测18
  • 2.2.2.4 引物合成18-19
  • 2.2.2.5 gDNA去除19
  • 2.2.2.6 cDNA合成19
  • 2.2.2.7 RT-qPCR检测19-20
  • 2.3 统计学方法20-21
  • 第3章 结果21-31
  • 3.1 HE染色21-23
  • 3.2 RNA浓度、纯度及完整性23-24
  • 3.3 RT-qPCR24-27
  • 3.4 内参基因27
  • 3.5 各RNA的相对表达量 2-ΔΔCt与PMI的单因素方差分析27-28
  • 3.6 各RNA的ΔCt值与PMI的曲线回归分析28-31
  • 第4章 讨论31-35
  • 第5章 结论35-36
  • 小结36-37
  • 参考文献37-41
  • 致谢41-42
  • 作者简介42-43
  • 综述43-53
  • 参考文献51-53

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