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《青海大学》 2017年
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大黄油菜粒色性状候选基因的定位克隆及功能分析

王艳花  
【摘要】:白菜型油菜(Brassica rapa L,2n=20,AA)为十字花科芸薹属作物,属于栽培油菜基本种。我国是白菜和白菜型油菜的起源中心,与甘蓝型油菜相比,其起源和栽培历史悠久,遗传资源丰富,具有天然而稳定的黄籽资源。目前,已有大量研究表明,与普通黑褐籽油菜相比,黄籽油菜具有油质清澈、脂肪和蛋白质含量高、皮壳率低、饼粕饲用价值高、且单宁等有毒物质含量低的优点。因此,黄籽作为优良油菜品种的一种重要的指示性状受到人们的重视,黄籽油菜品种的选育一直是重要的育种目标。本研究通过全基因组重测序结合遗传连锁图谱对白菜型黄籽油菜大黄的粒色基因进行了精细定位,并对粒色候选基因进行克隆及功能分析,初步鉴定了控制大黄粒色的目标基因。此外,研究了黄褐籽种子形成过程中种皮色泽的动态变化规律及类黄酮代谢中目标基因及其他相关转录因子与结构基因的差异表达。揭示了白菜型油菜种皮中色素在种子发育时期的积累规律,为候选基因与类黄酮途径其他各基因的调控机理提供初步线索。主要研究结果如下:1.精细定位大黄油菜粒色基因,在前人对大黄油菜粒色基因定位的基础上,通过新开发得到的8个特异性SSR分子标记及实验室已开发7个特异性标记,进一步加密遗传连锁图谱,并得到整合后的物理图谱,将目标基因锁定在A9染色体上一段1.08Mb(A9:18.26Mb-19.34Mb)区间。通过全基因组重测序定位大黄油菜粒色基因,结果显示三个候选区段位于A9染色体上(17.83 Mb-18.93 Mb;20.53 Mb-20.99 Mb;22.57 Mb-26.09 Mb)。其中,重测序定位所得候选区段之一(17.83 Mb-18.93 Mb)与遗传连锁图谱定位结果存在大段重叠(overlap),并且该重叠区段内包含5个与目标基因共分离的连锁标记。结合分子标记构建遗传连锁图谱的方法和全基因组重测序的定位方法将目标基因所在区间缩短为678 Kb(A9:18.26 Mb-18.93 Mb)。2.大黄油菜粒色候选基因Brtt1的克隆及序列分析,在BRAD数据库中检索发现候选区间(A9:678Kb)共包含46个候选基因。通过与拟南芥全基因组序列的同源比对,并参考这46个候选基因同源基因的功能注释,分析发现该区段仅包含一个与色素合成相关的候选基因BrTT1(Bra028067),其拟南芥同源基因为功能已知的类黄酮途径关键基因TT1(At1g34790)。且在拟南芥中TT1基因突变体表现为透明种皮的性状,推测BrTT1基因为大黄油菜粒色基因的关键候选基因。利用白菜基因组序列,扩增获得BrTT1全长序列4586bp,其中包含启动子片段1796bp,终止子下游序列986bp,编码区序列1804bp,该基因包含有2个外显子和1个内含子。与白菜基因组序列BrTT1参考序列不同的是,该序列在起始密码子上游39bp处提前编码,导致白菜型油菜褐籽中BrTT1序列的第一外显子比参考序列多39碱基,但未引起移码突变。等位基因序列分析,结果发现黄籽Brtt1与褐籽BrTT1的启动子序列完全一致,与褐籽序列相比,黄籽材料中Brtt1在外显子区存在7处碱基替换,内含子区存在13处SNP位点,且存在2bp、9bp、114bp片段缺失。进一步进行氨基酸序列分析,发现大黄材料Brtt1编码蛋白序列有4处氨基酸同义突变,有3处氨基酸有义突变,分别为N45H、S294Y、H299L。将BrTT1基因编码氨基酸序列提交至ExPASy数据库(http://www.expasy.org)进行蛋白结构预测,结果显示BrTT1编码WIP锌指结构转录因子蛋白,其分子式为C145C148H161H165,属于C2H2类型锌指蛋白。3.大黄油菜粒色候选基因BrTT1的遗传转化,利用花絮浸染农杆菌介导的遗传转化方法,将BrTT1基因全长转入拟南芥tt1突变体CS82中,共得到20株T1代阳性苗,粒色完全恢复为野生型种皮颜色褐色,且恢复率为100%。将T1代阳性苗转化株继代至T3代苗,粒色性状表现稳定。BrTT1基因能够完全恢复tt1突变体粒色性状,使其表现为野生型粒色性状。BrTT1基因与拟南芥同源基因TT1有相似的基因功能,参与类黄酮代谢途径。分别扩增黄褐籽BrTT1全长ORF序列,构建超量表达载体p35S::TT1与p35S::tt1,采用农杆菌介导的花絮浸染的方法分别转化拟南芥tt1突变体CS82。载体p35S::TT1所得31株T1代阳性苗,且种子粒色完全恢复至野生型种子粒色,载体p35S::tt1所得39株T1代阳性苗,种子粒色与突变体CS82粒色相近,仍为亮黄色。构建BrTT1亚细胞定位载体,通过农杆菌介导的烟草叶片下表皮细胞和洋葱内皮层细胞转化法,瞬时表达BrTT1:GFP融合蛋白,将BrTT1定位于细胞核中,这符合转录因子的特征。4.黄褐籽不同发育时期种皮中色素积累规律与候选基因BrTT1及类黄酮代谢相关基因的差异表达,通过体视镜观察并比较黄褐籽材料种子形成过程中种皮色泽变化,种子发育中期(授粉后28天、35天)黄褐籽材料的粒色性状差异较大,褐籽材料种皮色泽明显变为褐色,而黄籽材料在整个种子发育过程并未存在粒色性状的较大变化,表现为透明种皮,呈现种胚的颜色。通过qRT-PCR分析可知,候选基因BrTT1的主要表达部位在种子形成时期,且种子形成前期和中期(授粉后7天、14天、21天、28天、35天)黄褐籽材料中BrTT1的表达量达到极显著差异,褐籽表达量显著高于黄籽。在授粉后21天褐籽材料中BrTT1的表达量达到最高峰值,但在种子形成后期(授粉后49天)BrTT1在黄褐籽材料中的表达量并未达到极显著差异。对大黄油菜粒色性状候选基因BrTT1及类黄酮代谢途径其他相关的8个结构基因和6个转录因子在黄褐籽种子形成不同时期材料中的表达量进行热图分析和表达谱分析,Br TT3、BrTT18、Br BAN在黄褐籽材料中表达差异较大,且褐籽材料中检测到这些基因的大量表达,而在黄籽材料中几乎不表达。结合已有对其他植物中TT1的研究结果,初步推断白菜型油菜种皮中类黄酮代谢相关基因的差异表达可能是导致黄褐籽种皮粒色差异的根本原因。粒色性状候选基因BrTT1调节因子在大黄油菜黄籽材料中的异常表达,导致靶基因BAN及类黄酮代谢路径其他结构基因的异常表达或不表达,阻断了原花色素的积累,从而使种皮表现为透明种皮形成黄籽。
【关键词】:白菜型油菜 粒色 全基因组重测序 BrTT1 类黄酮代谢
【学位授予单位】:青海大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S565.4
【目录】:
  • 摘要7-10
  • Abstract10-15
  • 第1章 文献综述15-28
  • 1.1 白菜型油菜黄籽性状的研究15-18
  • 1.1.1 黄籽油菜的品质特点15-16
  • 1.1.2 白菜型黄籽油菜的遗传特性16-17
  • 1.1.3 黄籽性状种皮色泽基因的定位研究17-18
  • 1.2 拟南芥和白菜型油菜起源、进化的相关性研究18-19
  • 1.3 拟南芥类黄酮途径透明种皮(Transparent Testa,TT)基因的研究19-23
  • 1.3.1 拟南芥类黄酮代谢途径19-21
  • 1.3.2 拟南芥透明种皮基因的研究21-23
  • 1.4 油菜同源TT基因的表达和克隆研究23-24
  • 1.5 高通量测序在性状定位上的应用24-26
  • 1.6 本研究的目的与意义26-28
  • 第2章 精细定位大黄油菜粒色性状候选基因28-42
  • 2.1 实验材料28-29
  • 2.1.1 材料特征28-29
  • 2.1.2 群体构建29
  • 2.2 主要的实验仪器及试剂29
  • 2.3 实验方法29-34
  • 2.3.1 开发更紧密连锁的SSR标记并构建遗传连锁图谱29-30
  • 2.3.1.1 材料选取29-30
  • 2.3.1.2 SSR标记开发及图谱构建绘制30
  • 2.3.2 基于分离群体分组分析法(BSA)的全基因组重测序30-34
  • 2.3.2.1 材料选取及样品检测30-31
  • 2.3.2.2 文库构建、库检及测序31-32
  • 2.3.2.3 重测序原始数据的生物信息学分析32-34
  • 2.4 结果与分析34-41
  • 2.4.1 SSR标记开发和遗传连锁图谱构建34-35
  • 2.4.2 全基因组重测序定位目标基因所在候选区间35-39
  • 2.4.2.1 测序样品质量控制及测序流程35-37
  • 2.4.2.2 子代SNP-index及ΔSNP-index分析37-39
  • 2.4.3 ΔSNP-index结合遗传连锁图谱精细定位目标基因39-41
  • 2.5 讨论41-42
  • 第3章 大黄油菜粒色候选基因BrTT1的克隆及功能研究42-67
  • 3.1 实验材料和试剂42-43
  • 3.1.1 实验材料42
  • 3.1.2 菌株和质粒42
  • 3.1.3 主要仪器设备及试剂42-43
  • 3.2 实验方法和步骤43-52
  • 3.2.1 DNA和RNA提取43-44
  • 3.2.2 反转录总cDNA第一链的合成44
  • 3.2.3 基因序列分析及系统进化树构建44-45
  • 3.2.4 互补转化载体构建45-49
  • 3.2.4.1 候选基因BrTT1全长克隆45
  • 3.2.4.2 候选基因全长载体的构建与鉴定45-47
  • 3.2.4.3 载体pTT1::TT1转化拟南芥tt1突变体CS8247-48
  • 3.2.4.4 载体pTT1::TT1转化白菜型油菜黄籽亲本大黄48-49
  • 3.2.5 超量表达载体的构建49-50
  • 3.2.5.1 全长开放阅读框(ORF)序列的克隆49
  • 3.2.5.2 超量表达载体的构建与鉴定49
  • 3.2.5.3 超量表达载体p35S::TT1与p35S::tt1转化拟南芥tt1突变体CS8249-50
  • 3.2.6 亚细胞定位载体的构建50-52
  • 3.2.6.1 亚细胞定位载体片段的克隆50
  • 3.2.6.2 亚细胞定位载体的构建与鉴定50
  • 3.2.6.3 亚细胞定位载体转化洋葱表皮细胞和本氏烟草(N.benthamian)50-52
  • 3.3 结果与分析52-64
  • 3.3.1 白菜型油菜粒色性状候选基因BrTT1的克隆及序列分析52-55
  • 3.3.2 候选基因BrTT1的蛋白序列分析、结构预测及进化分析55-58
  • 3.3.3 BrTT1基因的遗传转化互补分析58-61
  • 3.3.4 BrTT1基因的超量表达分析61-62
  • 3.3.5 BrTT1基因的亚细胞定位分析62-64
  • 3.4 讨论64-67
  • 3.4.1 白菜型油菜粒色基因与拟南芥TT基因的关系64
  • 3.4.2 大黄油菜种皮色泽形成机制的初步推断64-65
  • 3.4.3 白菜型油菜遗传转化体系的探讨65-67
  • 第4章 白菜型油菜黄褐籽种皮中类黄酮积累动态规律及类黄酮途径基因差异表达分析67-78
  • 4.1 主要实验仪器试剂及实验材料67
  • 4.1.1 主要实验仪器及试剂67
  • 4.1.2 实验材料67
  • 4.2 实验方法和步骤67-69
  • 4.2.1 不同时期组织材料的选取67-68
  • 4.2.2 不同时期组织材料总RNA的提取及cDNA第一链的获得68
  • 4.2.3 类黄酮途径基因的差异表达68-69
  • 4.3 结果与分析69-76
  • 4.3.1 白菜型油菜黄褐籽不同发育时期种子粒色性状动态变化69-70
  • 4.3.2 白菜型油菜黄褐籽不同发育时期的种皮中类黄酮代谢相关基因差异表达分析70-76
  • 4.4 讨论76-78
  • 4.4.1 白菜型油菜黄褐籽种皮中原花色素的积累可能导致黄褐籽种皮粒色的差异76
  • 4.4.2 白菜型油菜种皮中类黄酮代谢相关基因的差异表达可能是导致黄褐籽种皮粒色差异的根本原因76-78
  • 第5章 结论78-82
  • 5.1 主要研究结果78-80
  • 5.2 本研究创新之处80
  • 5.3 下一步研究计划80-82
  • 参考文献82-98
  • 致谢98-99
  • 附录99-105
  • 作者简介105
  • 已获奖项105
  • 参与科研项目及论文发表情况105

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