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《青海师范大学》 2010年
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青海省部分地区冬虫夏草遗传多样性RAPD分析

王伟  
【摘要】:冬虫夏草为传统名贵中药材。冬虫夏草资源在青海省的分布区主要是在青南高原的玉树、果洛二州,在青海中部也有分布。本论文采用RAPD分子标记技术对青海省不同产地的20份冬虫夏草样品进行了多态性分析和聚类比较,从而为我省冬虫夏草资源在遗传多样性保护,分类研究,遗传图谱构建等方面积累了资料,为其他药用物种进行RAPD实验提供参考和借鉴。通过研究,取得了以下进展: 1.对分别用SDS法、改良CTAB法两种方法提取的冬虫夏草基因组DNA,进行电泳检测和紫外分光光度的检测。结果表明两种方法均可获得完整的冬虫夏草基因组DNA,但是改良CTAB法提取的冬虫夏草DNA质量较好,电泳检测的谱带清晰稳定,无降解。同时采用改良CTAB法提取的DNA的OD260/OD280值相对较好,间于1.6-2.0之间,说明DNA质量较好。因此,通过以上2种方法的对比可以选择了改良的CTAB法进行冬虫夏草DNA基因组的提取。 2.实验对PCR反应体系中5个重要因子进行了正交试验,筛选出最优的反应体系,并在此最优体系的基础上,分别对退火温度、扩增循环数进行了单因素试验,得到了RAPD反应合理的热力学程序,确定了一套优化的冬虫夏草RAPD反应体系和PCR扩增条件。通过正交试验得到了冬虫夏草RAPD-PCR的最佳扩增体系为:20μl总反应体系中包含,35 ng模板DNA,2.0 U Taq酶,0.4μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.5 mmol/L Mg~(2+)。其热循环程序为:95℃预变性3 min之后进行40次循环,94℃变性60 S,37℃退火1 min,72℃延伸2 min。最后72℃延伸5 min,保存于4℃。 3.用40个随机引物对20份冬虫夏草样品进行了RAPD分析,成功地筛选出了9个适合于冬虫夏草RAPD分析的随机引物,这些引物可以扩增出丰富清晰的条带。这9个引物进行PCR扩增后,共检测到65个位点,平均每条引物检测到7.2个位点,其中呈多态性位点57个,平均多态性条带数为6.3条,多态性位点比率P为87.69 %,9个引物的多态位点比率从75 %--100 %不等。 4.根据随机引物对20个冬虫夏草样品的扩增结果构建0/1矩阵,在NTSYS软件上计算出各品种间的相似系数,品种间的相似系数决定了品种间的亲缘关系,相似系数越大,亲缘关系越近。20个冬虫夏草样品间的相似系数介于0.1818-0.9876之间。其中样品18和20的相似系数最大为0.9876,表明两者亲缘关系最近。聚类分析结果表明:五个样地的20个样品,每个样地的样品均聚在一类,表明相似系数与样品的地理位置密切相关。
【学位授予单位】:青海师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S567.35

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