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《宁夏大学》 2017年
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产气荚膜梭菌Beta2毒素的细胞毒性与致病机理研究

曾瑾  
【摘要】:产气荚膜梭菌是引起人及家畜出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌,菌体产生的多种外毒素在产气荚膜梭菌致病性中扮演了重要角色,产气荚膜梭菌Beta2毒素(CPB2)即为其中一种主要的致死性毒素。目前,关于Beta2毒素细胞毒性和致病机理的研究,国内外报道均很少,而只有深入地研究其生化特性、细胞毒性和致病机理才能更好地预防、检测和治疗该菌感染引起的疾病。本项目利用基因重组技术获得纯化的重组Beta2毒素蛋白(rCPB2),制备和筛选获得针对该蛋白的单克隆抗体,并对Beta2重组毒素作用靶细胞的过程进行示踪研究;通过分析纯化Beta2重组毒素作用靶细胞后的细胞凋亡率、ROS和NO的积累量、线位体膜损伤情况,以及BCL-2蛋白家族及Caspase蛋白家族等细胞凋亡信号通路中蛋白分子的表达变化,探讨了 Beta2毒素的细胞毒性,揭示其诱导宿主细胞损伤的可能分子机制。最后利用纯化的CPB2重组毒素蛋白对小鼠以尾静脉注射和灌胃两种途径分别作用于成年小鼠和乳鼠体内,检测分析了小鼠血清、小肠组织和脾脏中的Th1/Th2/Th17细胞亚群分泌的炎性细胞因子的变化。综合评价分析以上rCPB2的细胞毒性及可能诱发机体的炎性损伤机制,揭示了 Beta2毒素对宿主细胞的损伤机理,阐明产气荚膜梭菌感染引发动物肠炎的可能致病机制,为进一步开展产气荚膜梭菌的致病机理研究和制订免疫预防策略提供理论依据。主要取得了以下研究结果:1、利用基因重组技术构建并筛选获得BL21(pTIG-cpb2)重组大肠杆菌,实现了 Beta2重组毒素的大量表达,并利用AKTA纯化系统的金属离子亲和层析法获得纯化的重组Beta2毒素(rCPB2);经去除内毒素后,以人正常结肠黏膜上皮细胞(NCM460)为靶细胞,使用噻唑蓝比色检测技术对纯化Beta2重组毒素的毒性进行了初步检测;结果表明,重组Beta2毒素具有与天然毒素相似的生物学毒性,其ID50为15μg/mL。2、通过杂交瘤细胞融合技术建立并筛选获得三株针对产气荚膜梭菌Beta2毒素的杂交瘤细胞系,McAb 1E23,2G7和2H7;经检测确定三种单克隆抗体(McAb)均能通过免疫印迹、ELISA、免疫荧光染色实验和毒素中和实验识别重组的rCPB2。在所有测试中,McAb 1E23在这三种McAb中显示出对rCPB2毒素蛋白和天然CPB2毒素蛋白最宽泛和最特异性的免疫学反应,而且其对rCPB2的免疫荧光分析染色还示踪证实了 rCPB2首先通过与细胞膜结合,然后跨膜转移至细胞质的动态变化过程;这些抗体将为研究CPB2的细胞毒性与致病机制、毒素的检测提供可靠的工具,甚至可能在临床治疗时中和CPB2毒素发挥作用。3、纯化的重组产气荚膜梭菌Beta2毒素(rCPB2)刺激人正常结肠黏膜上皮细胞(NCM460)后诱导了 Caspase依赖性的细胞凋亡程序,这一过程具有毒素作用剂量和时间的依赖性,同时伴随着细胞线粒体膜电位下降、促凋亡蛋白Bax、Puma的表达水平的上调,抗凋亡蛋白Bcl-xl、Mcl-1和phospho-Bcl-2的表达水平的下调。4、通过尾静脉注射和灌胃两种途径将纯化的产气荚膜梭菌Beta2毒素重组蛋白(rCPB)分别作用于成年小鼠和乳鼠后,利用蛋白芯片技术检测小鼠血清、小肠和脾脏组织中Th1、Th2、Th17细胞亚群分泌的细胞因子变化的结果显示,rCPB2处理的成年小鼠和乳鼠的血清、小肠和脾脏组织中 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、GM-CSFandTNF-α 的含量均与未处理组有显著性差异,提示rCPB2体内毒性作用过程可能与诱发机体的炎症反应相关。综合以上Beta2重组毒素作用于细胞模型和动物模型所获得的结果,我们推测产气荚膜梭菌Beta2毒素刺激动物肠黏膜上皮细胞的损伤机制可能是:Beta2毒素产生后,会在短时间内结合到宿主细胞膜上,并迅速转运至胞浆,刺激靶细胞TNF-α等炎性细胞因子的表达并发生炎性反应,同时破坏了受刺激细胞的线粒体膜的完整性,并积累过量的ROS,启动了依赖Caspase的细胞凋亡途径,造成受刺激细胞的凋亡,进而造成动物肠道的损伤,引发动物肠炎的发生。
【学位授予单位】:宁夏大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S859.8

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【参考文献】
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