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超高压处理下芽孢皮层肽聚糖支架非酶水解的研究

杜文斌  
【摘要】:本文研究了 HPTS(High Pressure Thermal Sterilization,HPTS,热辅助超高压杀菌技术)条件下芽孢皮层肽聚糖支架(peptidoglycan,PG)的水解变化趋势,并初步探讨了其水解机制。以PG结构化学键断裂为研究主线,先用酶水解PG,使用超高压、热和化学物质不同组合手段,运用紫外吸收光谱、反相高效液相色谱、基质辅助激光解析飞行时间质谱、电喷雾-离子阱,四极杆液质联用质谱等分析其结构的变化,运用质谱技术研究PG结构和各种处理下的水解规律。揭示和完善超高压条件下PG水解的相关机制,阐明超高压杀菌机理。研究得主要结论如下:1、首先研究了提取PG的方法,然后通过试验确定RP-HPLC法分析PG水解物的最佳条件。在WelchUltimate AQ-C 18色谱柱上,柱温为30℃,流速为1 mL/min,紫外检测波长为206 nm,梯度洗脱时间为120min,流动相为甲醇溶液和0.05 M磷酸盐缓冲溶液(pH=4.31),在0~5 min时使用100%磷酸盐缓冲溶液,在5~120min时流动相中的甲醇浓度从0梯度增加到30%。结果表明,用RP-HPLC法分析PG水解物是可行的,为研究高压热处理下PG支架水解机理,并进一步阐明高压热处理杀灭细菌芽孢的机理提供了研究方法支撑。2、研究了常温下超高压和超高压结合乙醇对PG作用。设置不同梯度压力对PG进行处理,实验发现:常温下150 MPa、300 MPa、450 MPa处理PG,并未发现其水解。450 MPa压力结合15%、75%乙醇对PG进行处理时,并未发现其发生水解。研究了 HPTS处理对PG和枯草杆菌芽孢的灭活效果和机制。实验发现:60℃、530MPa处理15 min时,PG发生了水解,此条件协同pH=4缓冲液、75%乙醇并未发现PG发生水解,其对PG可能有保护作用。60℃、530 MPa处理15 min时,枯草杆菌芽孢上清液析出物明显高于没有压力条件处理的。3、研究了 PG水解物机制辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF)、HPLC-MS和ESI-LCQ分析最佳条件。MALDI-TOF一级质谱扫描出的物质与PG目标物质分子量基本一致。通过标品与样品的母离子和子离子扫描方法确定了合适的定性定量离子,建立的HPLC-MS、ESI-LCQ质谱检测方法,具有定量准确、分析时间短、灵敏度和精密度高的特点。对后续研究PG水解物定性、定量检测提供了方法支撑。


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