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枸杞成熟过程中多糖差异分析及蛋白组学研究

赵宇慧  
【摘要】:果实成熟是一个复杂的生理生化过程,除客观因素外,受基因和表观遗传因素调控。前人对枸杞果实发育过程的研究主要集中在环境因子对果实品质形成的影响,发育过程中营养成分的积累等方面,对枸杞果实发育成熟过程的蛋白质组学的研究尚未见报道,对有效成分多糖的产生及在植物体内的运输和储存过程还未明确。为了研究枸杞成熟过程中多糖积累调控机制,本课题以不同发育时期枸杞果实为原料,对其多糖结构特性进行研究的同时,应用iTRAQ技术研究枸杞在成熟过程中机体内蛋白质的动态变化。具体研究结果如下:1)对枸杞不同发育时期多糖提取分离纯化,并对相关理化指标和组分进行分析,结果发现枸杞果实多糖含量随着生长发育阶段不断变化,黄变初期和盛果期多糖积累,且与其他时期果实有极显著差异(p0.0l),青果期多糖含量最低且与其他各时期果实多糖含量有显著差异(p0.05);果实中糖醛酸含量呈现先升高后降低趋势,幼果期、青果期、黄变初期与黄变后期、盛果期果实有极显著差异(p0.01);可溶性蛋白含量呈现缓慢增长后下降的趋势。黄变后期时枸杞果实可溶性蛋白含量最高。经过阴离子交换柱分级判断枸杞多糖是一种蛋白聚糖。随着枸杞的发育,枸杞多糖由中性糖逐渐转化为酸性糖。2)对枸杞不同发育时期多糖结构特性进行研究,通过高效液相色谱测得不同时期LBP2的分子量主要分布在6-40 KDa,主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖等6种单糖组成。红外光谱显示LBP2是一种糖环构象为β一吡喃环形式存在的酸性多糖。通过枸杞多糖的TG-DSC曲线结果,得到5种多糖的热性质基本相似,热分解过程主要存在两个阶段,第一阶段为结晶水的脱出,第二阶段为氧化分解,多糖的大分子骨架断裂。采用扫描电镜(SEM)观察了枸杞多糖的表面形态,看出枸杞多糖均是由球状结构聚集而成的片层状结构,但在不同发育时期具有不同的表面形态。3)应用iTRAQ对枸杞果实在成熟过程中的差异表达蛋白进行测定。用BCA法对枸杞各时期蛋白质定量,SDS-PAGE检测蛋白样品质量,iTRAQ标记后的样品进行质谱分析,结果显示,5种样品共鉴定出3910个蛋白,鉴定到的蛋白相对分子质量主要分布在10~70KDa之间,蛋白中等电点为6和7的最多,肽段序列长度在9~11个氨基酸的肽段比例最高,大部分蛋白所含的肽段数量在20个以内。差异蛋白鉴定结果显示,5种发育时期的枸杞,共鉴定到1799种差异蛋白。随着枸杞的发育成熟,差异蛋白质数量也逐渐增加,与幼果期枸杞蛋白相比,青果期、黄变初期、黄变后期上调蛋白质多于下调蛋白质。聚类结果表明,枸杞不同发育阶段蛋白的表达模式分为2类,幼果期,青果期,黄变初期的果实表达模式相近,黄变后期和盛果期果实表达模式相近。4)针对所有鉴定到的蛋白进行GO注释,结果表明,在枸杞成熟过程中鉴定到的差异蛋白主要分布于细胞和细胞器上,以具有催化活性和结合活性的蛋白为主,参与的生物过程主要与细胞和代谢过程有关。对枸杞成熟过程中的GO富集结果表明,差异主要集中以光合作用、能量代谢、糖代谢为主,氧化还原作用和代谢过程为主。对枸杞不同发育阶段下多糖代谢相关的蛋白的筛选蛋白得到203种蛋白。


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