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‘霞多丽’葡萄体细胞胚再生体系建立及畸形胚发生机理解析

雅蓉  
【摘要】:体细胞胚发生途径是实现葡萄遗传转化进行性状改良的基础。然而,胚性细胞诱导效率低、保持与扩繁能力差、畸形胚发生频率高等问题严重影响体细胞胚发生技术的应用与发展。特别是,大量畸形胚的发生严重制约体细胞胚的正常成苗。因此,解析畸形胚的发生机理或对畸形胚循环利用是葡萄体细胞胚再生体系中的核心问题之一。本研究以白色酿酒葡萄品种‘霞多丽’葡萄为试材,通过调节植物激素浓度与配比优化,建立高效稳定的酿酒葡萄‘霞多丽’体胚再生体系,以再生途径中产生的四种不同形态胚(正常胚、胚轴伸长胚、玻璃化胚、子叶融合胚)为材料进行畸形胚的循环利用研究,并从组织学鉴定、内源激素水平以及miRNAs调控层面解析了畸形胚发生的内在机理。主要结果如下:1.建立了‘霞多丽’体细胞胚再生体系。以未开放的小花蕾为试材,采用NaClO二次消毒进行花蕾接种时污染率与采样保存时间呈明显的正相关。在六种不同的胚性愈伤组织诱导培养基中,MC(NN69+0.55 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 NOA+1.24 mg·L-1 4-CPPU+30 g·L-1 Sucrose+3 g·L-1 Phytagel)、PIV(NN69+1.0 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1 Sucrose+ 3 g·L-1 Phytagel)、MEL2(NN69+2.0 mg·L-1 Melatonin+2.0 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1 Sucrose+3 g·L-1 Phytagel)培养基有利于胚性愈伤组织的诱导,诱导率分别为9.52%、8.63%、5.06%。初步确定了 4 μmol·L-1 ABA有利于体细胞胚的形成。利用扫描电镜观察不同组织和细胞的微观结构,发现胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的表面形态差异明显;而原胚团与胚性愈伤组织显微结构相似。萌发的胚置于添加0.2 mg·L-1 6-BA与0.1 mg·L-1 NOA的MS培养基可促进萌发。2.建立了‘霞多丽’葡萄体胚的循环诱导体系。将成熟子叶胚置于胚性愈伤组织诱导培养基MC、PIV、CIM上进行体胚的循环诱导,其中,CIM培养基(MS+0.5 mg·L-12,4-D+3.0 mg·L-1 Picloram+2.0 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1 Sucrose+3 g·L-1 Phytagel)有利于体胚形成胚性愈伤组织,诱导率为8.33%。通过对体细胞胚的不同部位子叶、胚轴、胚根进行循环诱导研究,结果表明子叶、胚轴愈伤组织诱导作用明显,诱导率达80%以上。不同类型体胚,即正常胚(Normal embryoids,NE)、胚轴伸长胚(Elongated cotyledonary embryoids,ECE)、子叶融合胚(Fused cotyledonary embryoids,FCE)对体胚循环诱导效果不同,仅正常胚与子叶融合胚诱导形成胚性愈伤组织,诱导率分别为 8.42%、4.44%。玻璃化胚(Vitrified embryoids,VE)在 X6 培养基(MS+60 g·L-1 Sucrose)上干枯褐化,直接形成原胚团或二次体胚。通过改良的苯酚品红溶液染色观察了胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织,其细胞表面形态存在较大差异。3.对‘霞多丽’葡萄畸形胚进行了形态组织学鉴定表明,畸形胚的维管系统与顶端分生组织较正常胚发育不完全。通过测定不同胚的内源激素含量,结果表明,在体细胞胚发育过程中,玻璃化胚的细胞分裂素(Cytokinin,CK)含量最少,为0.061 ng·g-1;正常胚内源生长素(Indole-3-acetic acid,IAA)与脱落酸(Abscisic acid,ABA)含量较畸形胚高,特别是正常胚ABA含量是胚轴伸长胚、玻璃化胚与子叶融合胚的4倍;胚轴伸长胚的内源水杨酸(Salicylic acid,SA)最高,玻璃化胚最低,分别为7.40 ng·g-1与1.99 ng·g-1;四种畸形胚的JA含量差异不显著。测定不同种类的内源激素比值以检验内源激素平衡,结果表明:正常胚中ABA/IAA、ABA/CK、CK/IAA均较畸形胚高。4.对‘霞多丽’不同形态的畸形胚进行高通量miRNAs测序。从三种畸形胚中共鉴定出51个显著差异表达的miRNAs,且下调miRNA数目居多;对潜在的靶点进行预测,共鉴定出59个共同的靶基因,且大部分的靶基因富集于多细胞生物发育与生物过程、解剖结构发育与内源刺激响应通路;并从共有靶基因中筛选出2个与激素相关、12个与转录因子相关的靶基因。对‘霞多丽’三种畸形胚中特异性miRNA-靶基因调控关系分析,发现有16个特异性表达的miRNA靶向82个转录因子参与畸形胚发生的调控,其中vvi-miR2950-5p与vvi-miR156b、vvi-miR172d与vvi-miR3935-3p、vvi-miR166a 与vvi-miR3630-3p 分别在 ECE、VE、FCE 中特异性表达,且调控的转录因子数量最多。此外,ECE中vvi-miR156b、vvi-miR2950-5p、vvi-miR397a调控的与激素相关的基因数量最多,VE与FCE靶向的基因数量较少。三种胚中与生长素(Auxin,AUX)和ABA相关的基因数量最多。


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