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《宁夏医科大学》 2015年
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叶酸干预对神经管畸形鼠Pax3基因及H3K27me3的作用研究

周长城  
【摘要】:目的构建全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的神经管畸形鼠模型,了解神经管畸形(neural tube defects,NTDs)形成过程中Pax3基因表达及H3K27三甲基化状态的情况,明确叶酸干预对这一现象的影响,探讨叶酸干预对神经管畸形的预防作用及可能的发生机制,为神经管畸形的早期诊疗提供可靠的理论依据。方法1.动物模型的建立:将18只性成熟健康雌性SD大鼠随机均分为3组:正常组、畸形组、叶酸干预组。其中,叶酸干预组于孕前2周喂食叶酸添加饲料(60μg/kg),直至终止妊娠;畸形组、叶酸干预组于E10d时给予ATRA 100mg/kg一次性灌胃,正常组给予相同剂量橄榄油。2.形态学观察:E15d剖宫取胎,对胎鼠进行形态学观察,记录胚胎总数、活胎数、死胎数、吸收胎数、畸形胎数、正常胎数,统计并分析伴发畸形率。3.病理学观察:胚胎固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片、HE染色,显微镜下观察各组胚胎病理学改变并摄影。4.血清叶酸、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)的测定:孕鼠腹部麻醉,胸部常规消毒,心脏穿刺采血于离心管静止30min后,以3000rpm离心,取上清。以磷酸盐缓冲液10:1稀释,分装至100?l离心管上机检测。5.Pax3基因表达量的测定:运用Western bloting技术和QRT-PCR技术对各组胚胎组织Pax3基因表达量进行定量分析。6.H3K27me3表达的检测:运用免疫组织化学技术和Western bloting技术对各组胚胎组织H3K27me3表达量进行定性、定量分析。结果1.胎鼠畸形率统计显示正常组胎鼠未见畸形,畸形组神经管畸形的发生率98.61%,叶酸干预组35.09%。其中,正常组胎鼠总数为61只,活胎60只,死胎1只,正常胎61只,未见吸收胎及畸形胎。畸形组总数72只,活胎72只,畸形胎71,其中包括吸收胎2只,正常胎1只。叶酸干预组总数57只,活胎57只,正常胎37只,畸形胎20只,未见吸收胎;2.病理学观察可发现正常组胎鼠发育正常,组织结构层次清晰。畸形组显性脊柱裂胎鼠背侧皮肤及皮下组织出现卵圆形缺损,深部脊髓结构紊乱,向外膨出,常伴有炎性细胞浸润。叶酸干预组脊柱裂位置较畸形组低,缺损面积小,损害程度低;3.正常组、畸形组、叶酸干预组孕鼠血清叶酸含量分别(62.350±10.678)ng/ml、(46.650±6.143)ng/ml、(117.375±6.564)ng/ml,血清Hcy含量分别为(2.875±0.419)μmol/l、(4.825±0.448)μmol/l、(3.500±0.265)μmol/l;4.免疫组化阳性结果显示,正常组有(-)表达2例,(+)表达10例;畸形组(++)表达1例,(+++)表达11例;叶酸干预组(++)表达9例,(+++)表达3例,正常组H3K27me3处于低表达状态,而畸形组呈现强阳性表达(P0.05)。叶酸干预组表达量比畸形组有所下降,但是并没有表现出差异性,与正常组相比,差异性明显,有统计学意义(P0.05);5.Western bloting蛋白检测显示畸形组Pax3基因表达量显著降低,而叶酸干预组表达量明显上调,并恢复至正常水平,H3K27三甲基化水平呈现负相关性;6.QRT-PCR检测Pax3基因表达量所得结果与Western bloting蛋白检测结果呈现一致性。结论1.叶酸能够有效降低全反式维甲酸诱导的鼠神经管畸形发生率;2.神经管畸形鼠中Pax3基因表达下调,H3K27三甲基化水平升高,叶酸干预可以有效纠正这一现象;3.神经管畸形的发生及叶酸的保护与Pax3基因表达及H3K27三甲基化状态存在紧密的联系。
【学位授予单位】:宁夏医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R715.3

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