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《新疆大学》 2018年
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新疆甜瓜eIF4E和MLO基因的敲除及功能分析

杨晶  
【摘要】:甜瓜(Cucumis melo L.)是新疆重要的经济作物,新疆主栽甜瓜品种“皇后”因具有优良的农艺性状,而广受消费者喜爱,但其易感病,使品质下降,严重时导致大面积减产。因此,提高抗病能力是甜瓜生产中急需解决的一个难题。CRISPR/Cas9是一种后天免疫系统,存在于所有的古生菌和大多数细菌中,已在动植物的基因工程和遗传育种中得到了广泛的应用。由于CRISPR/Cas9基因组编辑技术具有高效、便捷、成本低廉等优点而备受关注。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定点敲除新疆主栽甜瓜品种“皇后”的病毒病感病基因eIF4E和白粉病感病基因MLO,以期获得广谱抗病的甜瓜品种。主要结果如下:1.对分别接种病毒病和白粉病病菌的甜瓜叶片进行RT-PCR半定量,未接种的植株作为阴性对照,结果表明,接种病毒病和白粉病植株的eIF4E和MLO基因表达量高于对照,初步推测在侵染初期,病毒病和白粉病的病菌需要eIF4E和MLO基因的协助来完成在甜瓜中的生长繁殖。2.甜瓜eIF4E基因全长为2807 bp,总共含有5个外显子和4个内含子,靶序列中靶率为0.5906;甜瓜MLO基因全长为4500 bp,总共含有15个外显子和14个内含子,靶序列中靶率为0.7729。3.以双子叶植物敲除载体pP1C.4为模板进行sgRNA框的扩增,成功构建了重组载体pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO。4.探索不同浓度组合的IAA和6-BA对“皇后”外植体的影响,结果表明,当在MS固体培养基中添加的6-BA浓度为1 mg·L~(-1),IAA的浓度为0.05 mg·L~(-1)时,愈伤组织的生长状态良好,因而该浓度的激素组合对不定芽具有较高的诱导率。5.本实验确定了“皇后”对培养基中潮霉素的选择压以及头孢的最适抑菌浓度。当添加浓度为10mg·L~(-1)的潮霉素时,抑制了外植体的生长,可选择10mg·L~(-1)作为抗生素的临界浓度;当头孢的浓度为500 mg·L~(-1)时,对农杆菌的抑制效果最好,并且不会对外植体的生长造成太大影响,可将500mg·L~(-1)作为头孢的最适抑菌浓度。6.通过冻融法成功将重组载体pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO转入农杆菌GV3101中,经过为期一年多的遗传转化,经潮霉素筛选获得了11株转化植株,通过检测抗潮霉素基因初步得到9株阳性转化苗,对转化苗的靶序列进行测序比对,结果表明,在靶位点附近没有发生基因突变。本文为甜瓜的抗病研究提供了新的思路,为进一步研究甜瓜eIF4E和MLO基因的功能奠定了基础。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S652

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