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抗4-1BB(CD137)纳米抗体的制备及功能研究

刘娅菲  
【摘要】:4-1BB也被称为CD137,是T细胞表面一种重要的免疫激活检查点分子,由TNFRSF9基因编码,是最早被鉴定为免疫治疗共刺激靶点的肿瘤坏死因子受体超家族成员。由于针对4-1BB的不同激动型单克隆抗体在治疗癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的动物实验中取得了令人鼓舞的结果,4-1BB被认为是一个有吸引力的免疫治疗靶点。但临床实验显示,基于单抗结构的4-1BB激动剂由于Fc介导的ADCC效应会产生严重的毒副作用如肝毒性等,限制了其进一步的应用。因此,开发不含Fc结构的基因工程抗体作为激动剂有可能减轻或避免治疗中的不良反应。纳米抗体是源自骆驼重链抗体、仅具有重链可变区(VHH)的单域抗体,具有长的CDR3结构和分子模拟特性,并且优先结合受体的裂隙表位,在功能上模拟配体-受体相互作用中具有优势。因此,本研究提出假设,纳米抗体可以作为4-1BB良好的激动剂从而激活T细胞免疫。为了获得4-1BB纳米抗体,本研究采用噬菌体展示技术,从4-1BB免疫的VHH噬菌体展示文库中筛选4-1BB特异的纳米抗体,并进一步分析这些纳米抗体与T细胞表面结合、以及激活T淋巴细胞的能力,为开发一种不依赖Fc受体的免疫激动剂提供依据。1.抗4-1BB抗体噬菌体展示文库的构建采用人4-1BB胞外区重组蛋白免疫新疆双峰驼,经5次免疫后,血清特异抗体滴度达到1:64000。从300 m L外周血中分离得到5.5×10~9个淋巴细胞。提取淋巴细胞总RNA并反转录为c DNA,以其作为模板,利用两对特异性引物进行巢式PCR扩增VHH基因片段,获得约为450 bp的VHH目的片段,再与噬菌粒载体p MECS连接,电转化TG1感受态细胞,制备VHH基因文库。采用克隆稀释法测定文库大小,将过夜培养的转化子稀释成不同梯度,测得VHH文库的库容为3.64×10~9pfu。从文库中随机挑选出44个克隆,通过菌液PCR鉴定文库中VHH插入率为95%。选取27个VHH克隆进行DNA测序,结果表明,所有克隆均含有完整的VHH序列,其中4%(1/27)为冗余克隆,表明构建的VHH文库具有较高的多样性。2.抗4-1BB纳米抗体的筛选和制备采用重组4-1BB抗原包被ELISA板,对VHH噬菌体展示文库进行固相亲和淘洗筛选,共进行两轮筛选。4-1BB抗原包被浓度依次递减,第一轮50μg/m L,第二轮25μg/m L。随机挑选富集后的噬菌体感染的TG1克隆进行单克隆胞间质诱导表达,采用抗HA抗体检测胞间质上清与重组4-1BB抗原的结合。与对照抗原BSA结合OD_(450 nm)比值大于3.0以上判定为阳性结合克隆。结果显示,从两轮富集筛选中共得到49株阳性克隆,其中3株来自第一轮筛选,46株来自第二轮筛选。对49株克隆进行DNA测序,采用Clustal W进行氨基酸序列多重比对和进化关系分析。结果表明49株克隆分属3个不同家族,从不同家族克隆中挑选10株氨基酸序列同源性较低的VHH克隆,在TG1菌中进行IPTG诱导表达,其中5株克隆VHH-2B3、VHH-G3、VHH-C9、VHH-C10和VHH-2E2在胞间质中以可溶形式表达,经镍离子亲和纯化后得到了纯度约为90%的重组抗体用于后续分析。3.抗4-1BB纳米抗体与抗原的结合及功能分析对原核表达纯化的5株重组抗体,首先采用间接ELISA测定其与4-1BB重组蛋白的结合,结果显示其中2株纳米抗体VHH-2B3和VHH-G3与4-1BB具有一定的结合且呈浓度依赖性。为了分析这2株纳米抗体是否与细胞表面4-1BB受体结合,我们选择文献报道的4-1BB表达阳性的人急性白血病T淋巴细胞CCRFCEM细胞系作为模型,采用抗4-1BB单抗和4-1BB的配体蛋白4-1BBL,通过流式细胞术检测4-1BB的表达。结果抗4-1BB单抗和4-1BBL均能特异结合CCRFCEM细胞,而不与阴性细胞HEK293T结合。采用流式细胞术检测2株纳米抗体与CCRFCEM细胞的结合。结果显示,与对照Ig G抗体和无关纳米抗体相比,VHH-2B3和VHH-G3与CCRFCEM细胞具有显著结合能力,呈浓度依赖性,并且与荧光强度保持一致。在功能鉴定方面,我们分析了纳米抗体对CCRFCEM细胞的促增殖作用和激活作用。结果显示,在CCK8细胞增殖测定中,与IL-2和抗CD3单抗单独刺激相比,纳米抗体VHH-2B3和VHH-G3对CCRFCEM细胞均具有显著的促增殖作用(P0.05)。T细胞激活实验采用ELISA试剂盒检测刺激后CCRFCEM细胞分泌IL-2的水平。结果显示,在三种浓度4-1BB纳米抗体刺激下,与IL-2和抗CD3单抗单独刺激相比,VHH-2B3和VHH-G3并没有使IL-2的表达显著增多(P0.05)。综上,通过噬菌体展示技术,本研究筛选获得了与4-1BB重组蛋白和4-1BB阳性细胞具有一定结合活性的2株抗4-1BB纳米抗体,其对CCRFCEM细胞具有显著的促增殖作用,但未检测到显著的激活作用,可能与两株纳米抗体亲和力不高有关,今后需要进一步获得高亲和力的纳米抗体来验证其T细胞激活作用。


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