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《新疆大学》 2001年
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鼠透明带3cDNA的克隆及其在原核细胞中表达的研究

钱东  
【摘要】: 对许多种类的有害野生动物种群数量的控制已经成为一个非常值得研究的 课题。通过免疫避孕的方式来减小种群的数量,已经被提上了议事日程,在本 研究中,我们将鼠卵透明带3(mZP3)作为研究对象。由于卵透明带3作为精 子的初级受体是鼠卵透明带的一种主要糖蛋白,而且抗ZP3抗体能够阻止精卵 结合,因此ZP3被作为一种在免疫避孕领域非常有发展前景的候选免疫原。本 论文的研究工作主要包括mZP3 cDNA的克隆、融合蛋白的表达及抗血清的制 备。 首先,从Gene Bank~*上检索到ZP3cDNA序列,根据查到序列设计出特异 的引物。同时,解剖适龄雌性未孕的昆明白小鼠分离卵巢,从中提取出总RNA, 用偶连有OligodT的磁珠纯化出mRNA,在反转录酶的作用下,通过RT-PCR 得到mZP3 cDNA,将克隆到的cDNA连接到pUCm-T质粒上,通过蓝白斑筛 选和酶切鉴定,确定连接的正确性,最后用DNA测序仪对该序列进行测序(使 用引物为T_7和SP6反向引物),确认该克隆出序列同Gene Bank是一致的,长 度为1317bp。 然后利用测序结果和原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点序列及开放 阅读框确定共用酶切位点,将pUCm-ZP3上的mZP3基因用XhoI和EcoRI切 下,用同样的酶切割pGEX-4T-1,混合后连接,用HindⅢ&BgⅢ双酶切和PCR 的方法配合鉴定重组质粒GST-ZP3构建的正确性,将该质粒转化入大肠杆菌 BL21中,用IPTG诱导后,裂解细胞,用SDS-PAGE鉴定诱导效果,发现在 72kDa处出现多出的条带,表明有融合蛋白的表达。 大量培养表达融合蛋白的大肠杆菌,诱导后裂解,用偶连有GST的琼脂珠 大量纯化融合蛋白,纯化的融合蛋白SDS-PAGE显示为一条带,用提纯的融合 蛋白免疫大白兔,经过两次加强免疫后,采得血清,用ELISA检测校价为1:100O, 用Western blot检测在72kDa处出现条带,证明制备的纯化的融合蛋白和抗血 清是正确的。 克隆出小鼠ZP3的cDNA,并且通过原核表达载体在大肠杆菌中大量表达 ZP3基因所编码的活性蛋白,为以后进一步利用ZP3作为靶抗原进行免疫不孕 研究打下了基础。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q785;786

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【参考文献】
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