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《新疆大学》 2003年
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人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7 DNA疫苗的研究

张茂祥  
【摘要】: 人乳头瘤病毒16型E7相关DNA疫苗的研究 人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type sixteen,HPV16)是诱发妇女宫颈癌的启动因子,并与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关。它的早期基因E7是致癌的关键基因,在宫颈癌细胞中持续表达并为其恶化表型的维持所必需。针对于HPV16E7的疫苗研究,将有可能为HPV16病毒引起的宫颈癌等疾病的预防和治疗带来新的途径。HPV16E7蛋白是肿瘤特异性排斥抗原,含多个线性B细胞表位、CD8~+T细胞表位和CD4~+CTL表位,与MHC分子亲合力高,抗原性强,是设计HPV疫苗公认的靶抗原。本研究主要开展新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中HPV16E7基因的克隆与突变、融合蛋白的原核表达、抗血清的制备、野生型与各种突变型HPV16E7基因DNA疫苗免疫小鼠的研究。 研究工作首先根据GenBank上已发表的标准株HPV16基因组序列,分析设计了特异性引物,分别经PCR扩增出新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的HPV16E7基因,连接上pMD18-T载体,经DNA序列测定后,结果与GenBank中标准株HPV16E7基因进行同源性比较,确定已克隆出的新疆株HPV16E7基因序列与德国标准株的相同。从而为了解我国新疆地区宫颈癌患者组织中HPV16(新疆株)E7基因的结构特点积累了资料。 为了研究HPV16E7疫苗的需要,我们利用Werner博士惠赠的pGEX-2T-E7原核表达质粒转化入大肠扪:菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导后,裂解细胞,用SDS-PAGE鉴定诱导效果,发现在43kDa处有融合蛋白的表达。在大量诱导表达以后,用谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,蛋白电泳检测后以Bradford法定量蛋白含量,结果表明每升菌液可诱导产生融合蛋白20mg。将纯化的GST-HPV16E7蛋白联合弗氏佐剂,分数次免疫新西兰大白兔制备抗血清,以间接酶联免疫吸附(ELISA)测定最终抗血清效价是1: 新疆大学硕士论文 60000。分别用毕赤酵母和大肠杆菌表达的E7蛋白为抗原,利用蛋白免疫印迹 (Western blot)检测多克隆抗体,结果表明制备的抗血清具有高的特异性。上 述研究制备了高纯度的 HPV 6E7抗原蛋白,获得了高效价、高特异性的抗 HPV 6E7的血清,为检测新疆株HP们 6病毒和相关疫苗的研制奠定了基础。 由于己有研究表明野生型HPV 6E7蛋白具有致癌潜力,为了去除或减弱E7 的转化活性,根据HPV 6E7基因的特点,我们设计了三对带有突变位点的引物, 经过PCR反应分别对HPV16E7基因的第70位、第172位和第271位的碱基进行点 突变,经分别测序鉴定比较分析,结果得到的单点、双点和三点碱基突变的 HPV 6E7的基因。上述工作为进一步研究野生型和各种突变型HPV 6E7基因的 功能和DNA疫苗的研制奠定了基础。 根据制备DNA疫苗的要求,我们分别将pMD1载体上的野生型和各种突 变型HPV 6E7基因定向克隆到PCDNA3刀上,通过酶切鉴定后,得到野生型、 单、双允三点突变的 HPV 6E7基因的真核表达质粒,即 pCmA3-E7(W、 PCDNA3-E7(S)、PCDNA3-E7(D)、PCDNA3-E7(T)。将构建正确的各种重组质 粒大量提取纯化,并分别免疫小鼠,对其免疫效果进行ELISA和细胞因子检测。 结果表明野生型和各种突变型HPV 6E7基因的DNA疫茵,均能使免疫后小鼠产 生明显的抗E7抗体,并且IL*和YJFN检测结果基本相同。说明在小鼠的免疫 实验中,对野生型HPV 6E7基因的突变没有改变原有E7的免疫原性。本研究工 作为深入研究人乳头瘤病毒16型新型疫苗进行了有益的探索。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392

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