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《新疆大学》 2004年
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人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因疫苗免疫小鼠的研究

李萍  
【摘要】:人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因疫苗免疫小鼠的研究   人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV )是人类肿瘤病毒病因中重要的DNA 病毒, 高危HPV 易引起宫颈癌等恶性肿瘤, 其中最常见的是HPV 16 型和HPV 18 型。大量研究资料证明,50%的宫颈癌与HPV16感染相关。HPV16的E6基因持续表达E6蛋白,而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的,并且,正常组织中不存在这种蛋白。因此,E6蛋白就成为HPV16相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。本论文研究工作主要基于本实验室研究人员从新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中所克隆的HPV16E6基因,展开了三个方面的工作,主要包括HPV16E6蛋白在大肠杆菌中的高效表达、HPV16E6多克隆兔抗血清的制备以及HPV16E6基因疫苗的构建及其免疫小鼠的研究。 研究工作的基础为根据GenBank上已发表的标准株HPV16基因组序列,分析设计了特异性引物,分别经PCR扩增出新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的HPV16E6基因,连接上pUCm-T载体,经DNA序列测定后,结果与GenBank中标准株HPV16E6基因进行同源性比较,确定已克隆出的新疆株HPV16E6基因序列与德国标准株的基本相同。从而为针对我国新疆地区宫颈癌患者组织中HPV16(新疆株)E6基因的疫苗研究提供了基因来源。 为了得到检测小鼠抗体所需的抗原蛋白,我们用清华大学李慎涛博士惠赠的pET28a- HPV16E6原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选出转化体,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定诱导效果,发现在18kDa处有目的蛋白的表达。在大量诱导表达以后,离心法收集菌体,超声裂解细胞及溶菌酶处理后,离心获得包涵体沉淀,于适当的条件下洗涤,从包涵体中纯化E6蛋白,蛋白电泳检测后以标准蛋白MARKER为标准通过光密度扫描定量蛋白含量,结果表明每升菌液可诱导产生E6蛋白大约50mg左右,E6蛋白在包涵体中的纯 WP=5 度可达90%以上。 根据制备多克隆抗体的要求,将从包涵体中纯化的E6蛋白通过SDS-PAGE进一步纯化后,将E6蛋白条带从胶上割离,反复冻溶,碾碎后获得较大颗粒,此颗粒经冻干后碾碎成粉末联合弗氏佐剂,分数次免疫新西兰大白兔制备抗血清,以ELISA评估抗血清效价至少是1:20000。分别用毕赤酵母和大肠杆菌表达的E6蛋白为抗原,利用蛋白免疫印迹(Western blot)检测多克隆抗体,结果表明制备的抗血清具有高的特异性。上述研究制备了高纯度的HPV16E6抗原蛋白,获得了高效价、高特异性的抗HPV16E6的血清,为检测新疆株HPV16病毒和E6蛋白结构和功能的研究制打下基础。 由于近年来大量研究表明DNA疫苗具有诸多优点,在预防和治疗病毒感染所引起的疾病方面有广泛应用前景,为此我们根据DNA疫苗的制备要求,将pUCm-T- HPV16E6载体上的HPV16E6基因定向克隆到pCDNA3.0上,酶切鉴定表明我们构建了针对新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的HPV16E6基因的真核表达质粒,即pCDNA3- HPV16E6。将构建正确的重组质粒大量提取纯化,并免疫小鼠,对其免疫效果进行ELISA检测。结果表明HPV16E6基因的DNA疫苗,能使免疫后小鼠产生明显的抗E6抗体。本研究工作为深入研究人乳头瘤病毒16型新型疫苗进行了有益的探索。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R392

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