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《新疆大学》 2007年
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玛咖和新疆雪莲再生体系的建立及新疆雪莲转昆虫抗冻蛋白基因的研究

胡雪梅  
【摘要】: 当前随着社会的发展及医疗模式的改变,加上人类对“回归绿色,回归自然”的呼声越来越高,研究、开发、应用天然药物特别是植物药已成为世界性的热潮,这为药用植物的发展提供了前所未有的机遇。但在我国由于现代科学技术与传统中药产业有机结合不够等原因,药用植物(在我国主要是中草药)产业普遍存在着企业规模小、数量多、品种多、产量少、生产工艺与装备落后、产品质量不稳定、科技含量低、国际市场竞争力弱等问题;再加上经济全球化的快速发展和我国加入世贸组织,我国的中草药产业面临着严峻的挑战。目前药用植物的研究,尤其是中草药的研究,已由传统的凭经验来确定药方及各种药物的配伍开始向现代医学研究迈进。涉及到了药用植物有效成分及其次生代谢物的提取、分离、鉴定和药理、病理、毒理实验等方面的研究。药用植物研究已和现代科学技术、西方发达的医学技术紧密结合起来。并且药用植物在很多方面具有化学合成药物所不具备的优势。 本实验所研究的两种药用植物—原产于南美的药用植物玛咖及新疆雪莲都是目前国内外研究非常热门的药用植物。其中,原产于南美的药用植物玛咖因其丰富的营养成分而受到国内外的关注。在本实验中,以南美药食兼用植物玛咖无菌苗的子叶为外植体,对各种不同激素配比条件下的植株再生体系进行了探讨,结果表明:培养基MS + 2, 4-D 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L对愈伤组织诱导效果较好;而丛生芽的诱导培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L;生根培养基为1/2MS + IBA 0.1mg/L。组培植株已练苗成功,生长健壮,由此初步得到了玛咖再生植株,为玛咖的工厂化生产及功效成分的提取奠定了基础。 而新疆雪莲一直是科研、医药方面研究的热点,并且目前国内已有很多关于雪莲组织培养的报道。实验中参照了近年来所有关于雪莲组织培养的报道,并一一进行了验证,总结出了培养新疆雪莲的最佳组织培养基。实验中以新疆雪莲无菌苗的子叶、胚轴、胚根为外植体,对各种不同激素配比条件下新疆雪莲的离体植株再生问题进行了探讨,结果表明:培养基MS + 6-BA0.1mg/L + NAA2.0mg/L对愈伤组织诱导效果较好;而再生芽的诱导培养基为MS+ 6-BA0.4 mg/L + NAA0.05 mg/L +水解乳蛋白500 mg/L;生根培养基为1/4MS + NAA0.3 mg/L。经多次重复实验,该体系均获得了非常稳定而满意的效果。 研究过程中,建立了两种药用植物的组织培养体系,并对其进行了优化,得到了较好、较稳定的培养体系。在此基础上,使用本实验室已克隆出的昆虫抗冻蛋白,利用农杆菌介导的植物遗传转化方法对新疆雪莲离体再生进行了遗传转化的研究。研究过程中发现:以生长20天的新疆雪莲叶片为外植体有利于愈伤形成及芽的分化;确定了新疆雪莲的Kan筛选值为15mg/L;浸染时,当菌液浓度为OD600 0.3~0.5浸染7min、菌液浓度为OD600 0.7时浸染3 min时,卡那抗生素绿苗获得率为15%,随着菌液浓度的升高,OD600大于0.7时,在后期的筛选分化过程中抑菌非常困难,即使使用含有高浓度羧苄的MS液体培养基进行洗菌,也无法得到分化的绿苗;把含有目的基因的农杆菌经过活化后,对新疆雪莲叶片进行转化,经过筛选继代培养,得到第一批新疆雪莲转化植株共4株,抗性芽出芽率为67%,当芽长至3~5cm时,对4株转化植株进行PCR及PCR-Southern分子检测,均检测到了目的基因片段的存在,后期的研究工作仍在进行中。本研究为药用植物与生物技术相结合的相关研究提供了一定的参考信息,同时也说明新疆雪莲也可作为一种较好的遗传转化材料进行利用。此外,也可为利用植物作为动物抗冻蛋白的良好表达载体及植物抗冻蛋白与抗冻蛋白的机理研究提供实验参考。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S567.239

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