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《新疆大学》 2007年
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人乳头瘤病毒16型L1基因、小鼠及草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达

陈邦党  
【摘要】: 1.人乳头瘤病毒16型L1基因重组腺病毒载体的构建及表达人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV )是一种双链的小DNA病毒。高危型HPV可引起宫颈癌等恶性肿瘤,其中最常见的是HPV 16型和HPV 18型。大量研究资料证明,50%的宫颈癌与HPV16感染相关。因HPV有潜在的致癌性,故HPV疫苗的制备不能采用传统的减毒活疫苗或灭活疫苗。目前,HPV16疫苗研究集中于晚期蛋白L1及L2组成的基因工程亚单位疫苗。 HPV16晚期基因L1编码病毒的主要衣壳蛋白,在真核细胞中产生的HPV16L1或L1+L2可高效自行装配成病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)。由于VLPs不含DNA成分,且结构和天然病毒颗粒相似,能刺激机体产生抗体,保护机体不受同型别HPV感染而成为引人关注的免疫原。在前期的研究中,我们已经从新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中克隆获得HPV16 L1基因。该基因发生多位点变异,并形成突变的主流模式,这些突变引起HPV16 L1蛋白疏水性和抗原性的改变。L1基因的突变可导致HPV16逃避机体免疫识别,造成HPV16的持续感染。以新疆地区宫颈癌患者组织中的HPV16 L1基因开展疫苗研究,对预防HPV 16新疆流行株的感染将更为有效。 本研究将本室克隆的新疆株HPV16 L1基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带L1基因的重组腺病毒质粒pAd-L1,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,获得重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明L1基因已经整合到腺病毒基因组中,空斑法测定重组腺病毒RAd-L1的滴度为1.5×109 pfu /L,RT-PCR检测表明该重组腺病毒感染后的宿主细胞具有HPV16L1对应的mRNA表达;Western blot和间接免疫荧光检测表明L1基因在HEK293细胞能够有效的表达。制备了表达新疆人乳头瘤病毒16型L1基因的非复制型重组腺病毒,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗L1免疫应答能力的研究奠定了基础。 2.小鼠、草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达哺乳动物卵透明带(zonapellucida,ZP)是由卵泡细胞和卵细胞合成和分泌的,由ZP1、ZP2、ZP3三种硫酸化的糖蛋白组成,是受精过程中精子必须穿过的障碍。其中ZP3在受精过程中有两个重要作用:一是与精子专一性地结合;二是与精子结合后诱导精子的顶体反应。大量实验证明,阻断精子与ZP3的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程,因此,ZP3是利用免疫不育技术控制有害动物种群数量的理想靶抗原。 重组腺病毒载体可模仿病毒天然的感染方式,有效地将外源DNA导入宿主细胞内并表达天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白,能够诱导有效的特异性体液免疫应答和强烈的细胞免疫应答。本研究所用病毒载体为缺失E1和E3基因的人血清型5型复制缺陷性腺病毒,插入外源基因可达7.5kb;宿主范围广,可转染分化及未分化细胞;可获得高滴度的病毒,而且腺病毒并不整合到宿主基因组上,相对安全,基因转染后不会激活或者抑制宿主细胞基因的表达,因此作为免疫不育疫苗载体具有明显的优势。 本研究将本室克隆的草原兔尾鼠和小鼠的zp3基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带zp3基因的重组腺病毒质粒pAd-mzp3和pAd-lzp3,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明mzp3和lzp3基因已经整合到腺病毒基因组中;间接免疫荧光检测表明zp3基因在HEK293细胞中能够有效表达;病毒的滴度可达1.2×109pfu /L和1.3×109pfu/L;继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,RT-PCR检测表明构建的重组腺病毒感染后的宿主细胞具有mzp3和lzp3对应的mRNA表达,Western blot检测表明感染的HeLa细胞中zp3基因能够有效表达。本研究探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)和小鼠卵透明带3(mzp3)重组腺病毒载体疫苗,为进一步进行重组腺病毒活疫苗免疫不育技术控制鼠害的研究奠定基础。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

【参考文献】
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