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《新疆大学》 2010年
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牛新孢子虫病分子检测技术的研究

牛国辉  
【摘要】: 新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于宿主体内而引起的一种原虫病。该病对牛的危害尤为严重,主要造成母牛流产、产死胎以及新生犊牛的神经系统疾病,给畜牧业造成了巨大的经济损失。迄今为止,还没有有效药物和疫苗来防治新孢子虫病。对新孢子虫病的早期诊断是目前控制该病发生和蔓延的重要手段。为此,我们借鉴前人的工作基础,运用三种PCR方法(二温式PCR、实时荧光定量PCR和内标荧光定量PCR)和基因芯片技术建立了牛新孢子虫病的快速检测方法。结果如下: 1.采用均匀设计方法建立了牛新孢子虫病二温式PCR检测方法,以获得138 bp的犬新孢子虫特异性Nc-5基因核心片段定为感染了牛新孢子虫病。结果显示,扩增的目的片段大小为138 bp;重组质粒经BamH I、Hind III双酶切和PCR鉴定均得到预计扩增片段;序列分析表明,本试验扩增的Nc-5基因片段与GenBank公布的犬新孢子虫(X84238.1株)Nc-5基因序列同源性为98.55%。 2.建立了检测牛新孢子虫病的实时荧光定量PCR方法。结果表明,该方法与含Nc-5基因的模板质粒数呈现很好的相关性(R2=0.993),灵敏度可达10个拷贝的核酸分子/PCR反应,比常规PCR高1000倍,整个检测时间不到2 h。 3.通过设计引物和搭桥法PCR扩增,获得N. caninum荧光定量PCR内标模板,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该内标体系可以检测到10个拷贝的核酸分子/PCR反应,灵敏度比常规PCR高1000倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高荧光PCR检测准确率的目的。 4.根据犬新孢子虫Nc-5基因和牛疱疹病毒1型gB基因分别设计1对特异性引物和2条寡核苷酸探针。将标有荧光染料的PCR产物变性后与芯片上寡核苷酸探针杂交,实现同时对两种病原的检测,建立了犬新孢子虫和牛疱疹病毒1型基因芯片检测方法。此方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。可用于临床样品中两种病原的快速检测。 本研究成功建立了检测牛新孢子虫病的三种PCR方法和基因芯片技术,解决了现有牛新孢子虫病检测中的难题,对该病的快速检测具有较好的应用价值。
【学位授予单位】:新疆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S858.23

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【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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