收藏本站
《塔里木大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

甘草皂苷对LPS诱导的山羊瘤胃上皮细胞损伤的炎性影响研究

帕提古丽·毛拉红  
【摘要】:反刍动物瘤胃黏膜由于饲料使用不合理导致瘤胃酸中毒、菌群失调等症状,引起瘤胃免疫屏障损伤,严重影响动物生产性能,甚至导致死亡。本文拟通过体外LPS诱导山羊瘤胃上皮细胞损伤模型,研究甘草皂苷干预该损伤瘤胃上皮细胞模型的炎性因子及NF-κB信号通路表达的影响。分析甘草皂苷对体外LPS诱发的山羊瘤胃炎症反应的免疫调节作用机理,为解决反刍动物养殖过程中瘤胃损伤的预防及研究甘草提取物类饲料添加剂提供新的思路和参考数据。试验一山羊瘤胃上皮原代细胞的分离培养与细胞免疫荧光鉴定本试验体外分离山羊瘤胃上皮细胞,进行体外培养。试验选用健康状况良好的,体重约10 kg的1.5月龄健康的波尔山羊的瘤胃上皮组织,无菌操作成功分离瘤胃上皮细胞。用胰蛋白酶消化细胞,消化下来的细胞在37℃,5%CO_2培养箱中培养。镜下观察,当上皮细胞贴壁程度达到80%~90%时,进行细胞传代及纯化,细胞传代培养至第6代开始进行后续试验。以细胞计数法将把细胞密度调整为:1×10~3、1×10~4、1×10~5、1×10~6个/mL,接种至6孔、24孔、96孔培养板,在37℃,5%CO_2培养箱中进行培养。采用细胞角蛋白(cytokeratin,CK18)进行上皮细胞免疫荧光鉴定,结果显示细胞的胞浆经CK18免疫组化鉴定呈绿色荧光,且该细胞阳性染色表达CK18,证实该细胞为瘤胃上皮细胞。通过MTT法对不同细胞数的上皮细胞进行生长活性测定,结果表明1×10~6个/mL的细胞生长活性最好,显著高于其他组(P0.05)。试验二体外LPS诱导的山羊瘤胃上皮细胞损伤模型建立本试验使用LPS诱导山羊瘤胃上皮细胞,成功建立了亚急性瘤胃酸中毒炎症模型。采用MTT法检测LPS诱导后瘤胃上皮细胞的生长活性;用PCR法检测LPS诱导炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12mRNA表达的差异性检测,扫描电镜观察瘤胃上皮细胞形态结果,确定LPS最佳致炎浓度为50 mg/L。试验三甘草皂苷体外干预LPS诱导的瘤胃上皮细胞损伤炎性信号通路研究本试验旨在研究甘草皂苷体外干预LPS诱导的瘤胃上皮细胞损伤炎性信号通路。成功建立瘤胃上皮细胞炎症模型,随后经不同浓度甘草皂苷进行处理,一定时间收取细胞或细胞上清,进行Elisa、免疫荧光、Western blot、qRT-PCR等相关检测,确定最适甘草皂苷的作用浓度,同时分析甘草皂苷对通过LPS诱导后上皮细胞结构完整性的影响。结果表明:甘草皂苷明显降低了瘤胃上皮细胞上清液中NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的mRNA表达量,同时呈现了浓度依赖性。通过免疫荧光分析Occludin、Zo-1的分布结果可知,经不同浓度甘草皂苷处理后,上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、Zo-1的含量随甘草皂苷浓度增加而逐渐增多,证明甘草皂苷有效降低上皮细胞紧密连接蛋白受损,当甘草皂苷浓度为125 mg/L时Occludin、Zo-1的分布最多;Western Blot检测Occludin蛋白表达水平结果显示,甘草皂苷处理后瘤胃上皮Occludin蛋白表达水平明显提高,抑制了炎性因子TNF-α的活化;最后采用qRT-PCR法检测NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的mRNA表达量,结果表明,甘草皂苷浓度为最高时炎性因子mRNA的表达量最少;基因表达量与甘草皂苷浓度呈剂量依赖性,确定甘草皂苷最佳作用浓度为125 mg/L。综上所述,体外成功分离培养瘤胃上皮细胞,经LPS诱导山羊瘤胃上皮细胞可建立亚急性瘤胃酸中毒损伤模型,通过甘草皂苷处理可达到降低损伤及干预的目的。本实验进一步证实,甘草皂苷有效控制亚急性瘤胃酸中毒的发生,可减轻因亚急性瘤胃酸中毒而引起的瘤胃局部炎症。
【学位授予单位】:塔里木大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S827.5

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李伟,邹巧根,宋喆,吴如金;RP-HPLC法测定强力宁注射液及甘草提取物中三种甘草皂苷的含量[J];中国药科大学学报;2002年01期
2 李伟;王跃飞;文红梅;崔小兵;赵晓莉;;HPLC-DAD同时分析甘草中7种有效成分[J];中国药学杂志;2008年24期
3 刘建玲;周珏;曲凡;;RP-HPLC法测定栽培甘草中3种成分含量的比较研究[J];安徽中医学院学报;2006年04期
4 叶静;肖美添;汤须崇;黄雅燕;;HPLC-ELSD法测定甘草中3种甘草皂苷的含量[J];广东药学院学报;2009年04期
5 朱紫烨;田彦芳;张迁;虞立;何昱;;BP神经网络结合熵权法优化甘草皂苷提取工艺[J];中成药;2017年09期
6 杨会;郭远瑾;;甘草皂苷对单纯疱疹病毒性脑炎小鼠高迁移率族蛋白B1和Toll样受体水平的影响[J];中国老年学杂志;2014年13期
7 吴少杰,杨志娟,朱丽华,金风燮;甘草皂苷生物转化的研究[J];中草药;2003年06期
8 马鸿雁;邓雨娇;马倩;王静宜;许润春;;甘草的研究概况[J];中药与临床;2018年01期
9 严海兵;刘顺;万伟忠;;甘草皂苷对神经氨酸酶及磷脂酶A2的活性抑制及构象关系研究[J];现代中药研究与实践;2018年01期
10 王敏;刘彬;齐云;宋杨;谢忱;罗秀珍;蔡润兰;;甘草皂苷对桔梗皂苷急性毒性的影响研究[J];中国实验方剂学杂志;2008年01期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 王宇光;史新元;乔延江;;介观分子动力学方法测定甘草皂苷临界胶束浓度[A];第十一届全国计算(机)化学学术会议论文摘要集[C];2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 帕提古丽·毛拉红;甘草皂苷对LPS诱导的山羊瘤胃上皮细胞损伤的炎性影响研究[D];塔里木大学;2018年
2 苏艳桃;泡沫分离法浓缩、分离甘草水提液中皂苷类成分的研究[D];成都中医药大学;2006年
3 丁爱华;基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究[D];南京中医药大学;2013年
4 杨璇;甘草对葛根、黄芩增溶作用和机理的研究[D];北京中医药大学;2013年
5 刘彬;甘草、桔梗“药对”药效学环节之配伍机理研究(Ⅱ)[D];中国协和医科大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026