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《新疆农业大学》 2010年
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新疆新孢子虫株tNcSRS2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

杨帆  
【摘要】:新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(N.caninum)寄生在宿主体内引起的多种家畜共患的一种原虫病,此病对牛的危害尤为严重,主要造成母牛流产、产死胎以及新生儿的运动神经系统疾病,给畜牧业造成了巨大的经济损失。迄今为止,还没有防治新孢子虫病的有效药物和疫苗,也未建立综合防治措施,所以诊断方法的建立就显得尤为重要。本研究构建了新孢子虫原核表达载体,探索了包涵体蛋白的提取及复性方法,并建立了新孢子虫间接ELISA方法。为我国牛群新孢子虫病的流行病学监测、诊断提供有效手段。 本试验根据GenBank中已发表的新孢子虫NcSRS2基因序列,使用Oligo6.0生物软件设计一对引物,引入酶切位点并去掉NcSRS2蛋白的信号肽区。以IDEXX试剂盒检测为新孢子虫阳性的血液为样品,提取总DNA。通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段,克隆到pMD-18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pGEX-4T-2表达载体,转化BL21表达菌。并优化其表达条件,在37℃条件下,经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导4h后,获得了以包涵体形式表达的GST- tNcSRS2重组蛋白,分子量约为62.2kDa,表达量可占总蛋白的35%。用Western blotting表明该重组蛋白具有良好的反应原性,为建立新孢子虫病诊断试剂盒的研制奠定了基础。 为探索GST-tNcSRS2包涵体蛋白的提取条件和新孢子虫诊断方法。本试验将诱导获得的GST- tNcSRS2包涵体蛋白进行洗涤,使其纯度达到87%。然后经变性、纯化、复性后,采用GST亲和层析柱纯化。获得浓度为275μg/mL,纯度为95%的GST- tNcSRS2重组蛋白。然后以该蛋白作为包被抗原,建立用于检测新孢子虫抗体的间接ELISA方法。间接ELISA建立结果为:抗原最适包被浓度为7μg/mL,包被时间为4℃过夜,封闭液为0.5%脱脂乳,封闭时间为37℃作用1h;血清最适稀释度为1:100,作用时间为1h;酶标抗体最适稀释浓度为1:4000,作用时间37℃作用1h。判定标准(临界值OD450/630≥0.35者判为抗体阳性,OD450/6300.25者判为抗体阴性,介于两者之间为可疑。特异性检测未发现交叉反应。批内重复试验和批间重复试验,变异系数小于10%,说明具有很好的重复性,可为犬新孢子虫病的检测、诊断提供技术支撑。
【学位授予单位】:新疆农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.7

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【参考文献】
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