新牧1号杂花苜蓿抗逆相关基因的克隆和功能分析
【摘要】：新牧1号杂花苜蓿(Medicago varua Xinmu No.1)是中等程度耐盐,在轻微盐碱地区有大面积种植,已取得良好的经济效益和社会效益。但其耐盐能力仍然有限,要在盐碱地广泛种植,必须进一步提高新牧1号杂花苜蓿的耐盐能力。本研究从不同类型的抗逆相关基因入手,通过分析基因的功能和表达调控,为研究苜蓿耐盐分子机制和进一步分子育种提供依据。
(1)通过同源克隆策略和RT-PCR技术,克隆了新牧1号杂花苜蓿的MvNHX1、MvP5CS和MvDREB1基因,并以新牧1号苜蓿actin基因为内参基因,通过半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析在盐胁迫下0-24 h下MvNHX1、MvP5CS和MvDREB1基因表达情况。MvNHX1和MvP5CS基因在盐胁迫后表达均明显上调,MvDREB1基因在盐胁迫前后表达量变化不大,说明,MvNHX1和MvP5CS与苜蓿的耐盐性相关。
(2)通过染色体步移法克隆了MvNHX1和MvP5CS基因的启动子,利用生物信息学方法,对MvNHX1和MvP5CS基因的启动子和MvNHX1和MvP5CS蛋白的结构和功能以及细胞中的定位进行了分析。启动子分析表明两个基因的启动子序列中均含有通用启动元件和上游调控元件,MvP5CS基因启动子还具有高水平转录应答元件。序列分析发现MvNHX1属于Na+/H+反向运输蛋白家族。MvP5CS氨基酸序列比对与已知的其它植物的P5CS氨基酸序列同源性都在70%以上,且具有P5CS酶的六个保守区。进一步预测分析表明MvNHX1是一种跨膜的蛋白质,具有信号肽,位于质膜上；MvP5CS是一种亲水蛋白,位于细胞质中。
(3)利用农杆菌介导的叶盘转化法,将新牧1号苜蓿的MvNHX1和MvP5CS基因转入烟草,经分子检测证实MvNHX1和MvP5CS基因已成功转入烟草基因组中。对T1代转基因烟草在盐胁迫下RT-PCR分析表明,盐胁迫前后MvNHX1和MvP5CS基因在转基因烟草中稳定表达。盐胁迫和干旱胁迫下转MvNHX1和MvP5CS基因烟草萌发率均高于非转基因烟草。转MvNHX1基因烟草在耐盐性上表现较好,转MvP5CS基因在抗旱性上较好。盐胁迫下脯氨酸含量分析表明转MvNHX1和MvP5CS基因烟草比非转基因烟草在胁迫后的脯氨酸含量增幅大,而转MvP5CS基因烟草增幅比转MvNHX1基因烟草还要明显。转MvNHX1和MvP5CS基因烟草的MDA含量增加缓慢,而对照非转基因烟草MDA含量急剧增加,转MvP5CS基因烟草比转MvNHX1基因烟草MDA积累更慢。综合分析表明,转MvNHX1和MvP5CS基因可以提高烟草的耐盐性的抗旱性。MvP5CS基因在渗透调节和保护细胞膜方面作用更大。
【关键词】：新牧1号杂花苜蓿 MvNHX1 MvP5CS 耐盐性 抗旱性 【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S54
【目录】：
- 摘要3-5
- Abstract5-10
- 第一章 绪论10-27
- 1.1 逆境对植物的伤害10-12
- 1.1.1 盐害对植物的伤害10-11
- 1.1.2 干旱对植物的伤害11-12
- 1.1.3 低温对植物的伤害12
- 1.2 植物的抗逆性12-16
- 1.2.1 植物抗逆性类型12-13
- 1.2.2 植物抗逆分子机制13-16
- 1.3 抗逆相关蛋白16-24
- 1.3.1 Na~+/H~+反向运输蛋白16-20
- 1.3.2 脯氨酸及其合成的关键酶P5CS20-23
- 1.3.3 DREB转录因子(CRT/DRE BINDING FACTOR)23-24
- 1.4 本研究的目的和意义24-27
- 第二章 新牧1号杂花苜蓿MVNHX1、MVP5CS、MVDREB1的克隆和表达分析27-38
- 2.1 材料与方法27-31
- 2.1.1 试验材料27-28
- 2.1.2 试验方法28-31
- 2.2 结果与分析31-35
- 2.2.1 游离脯氨酸含量分析31-32
- 2.2.2 用三对基因引物RT-PCR结果32
- 2.2.3 筛选阳性克隆32-33
- 2.2.4 序列分析33
- 2.2.5 盐胁迫下基因表达分析33-35
- 2.3 讨论35-37
- 2.4 小结37-38
- 第三章 MVNHX1和MVP5CS基因启动子的克隆和MVNHX1和MVP5CS的生物信息学分析38-53
- 3.1 材料与方法38-40
- 3.1.1 试验材料38-39
- 3.1.2 试验方法39-40
- 3.2 结果与分析40-51
- 3.2.1 MvNHX1和MvP5CS基因启动子分析40-42
- 3.2.2 MvNHX1生物信息学分析42-46
- 3.2.3 MvP5CS生物信息学分析46-51
- 3.3 讨论与小结51-53
- 第四章 植物表达载体构建及获得转基因烟草53-64
- 4.1 材料与方法53-58
- 4.1.1 试验材料53
- 4.1.2 试验方法53-58
- 4.2 结果与分析58-63
- 4.2.1 植物表达载体PBI12-MVNHX1和PCAMBIA2300-MVP5CS构建58-59
- 4.2.2 PBI121-MVNHX1和PCAMBIA2300-MVP5CS转化农杆菌LBA440459-60
- 4.2.3 农杆菌介导法获得转基因烟草60
- 4.2.4 T_0代转基因烟草的PCR检测60-63
- 4.3 讨论与小结63-64
- 第五章 转基因烟草分子检测和抗逆性分析64-75
- 5.1 材料与方法64-66
- 5.1.1 试验材料64
- 5.1.2 试验方法64-66
- 5.2 结果与分析66-73
- 5.2.1 PCR检测66-67
- 5.2.2 RT-PCR检测外源基因表达67-68
- 5.2.3 种子萌发率分析68-69
- 5.2.4 脯氨酸含量分析69-70
- 5.2.5 丙二醛含量分析70-71
- 5.2.6 胁迫下形态学观察71-73
- 5.3 讨论与小结73-75
- 第六章 结论与展望75-76
- 6.1 结论75
- 6.2 展望75-76
- 参考文献76-85
- 致谢85-86
- 作者简介86
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|
|
| 1 |
慕平利,崔红;烟草叶片直接再生—基因转化体系的建立[J];河南农业科学;2005年04期 |
| 2 |
李玲,余光辉,曾富华;水分胁迫下植物脯氨酸累积的分子机理[J];华南师范大学学报(自然科学版);2003年01期 |
| 3 |
陶晶,李铁,孙长彬,仲崇卓,秦彩云,陈士刚,李岩,窦万君;植物盐胁迫研究进展[J];吉林林业科技;2003年05期 |
| 4 |
朱生伟,徐仲,朱祥春,史芝文;烟草叶组织培养再生系统的建立[J];吉林农业大学学报;1998年01期 |
| 5 |
高浦新;玉米在水分胁迫条件下脯氨酸的积累与抗旱性的研究探讨[J];江西农业学报;1997年04期 |
| 6 |
郭丽红;王定康;王德斌;陈雪;程威;陈善娜;;抗坏血酸和谷胱甘肽在小麦幼苗冷激诱导抗冷性中的变化[J];昆明师范高等专科学校学报;2007年04期 |
| 7 |
刘强,张贵友,陈受宜;植物转录因子的结构与调控作用[J];科学通报;2000年14期 |
| 8 |
吴亮其,范战民,郭蕾,李勇青,张文静,瞿礼嘉,陈章良;通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻[J];科学通报;2003年19期 |
| 9 |
孙艳香;王丹;白艳玲;王宁宁;王勇;;大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究：体内Na~+含量的降低是耐盐性提高的基础[J];科学通报;2006年08期 |
| 10 |
王劲;杜世章;刘君蓉;;植物耐盐机制中的Na~+/H~+逆向转运蛋白[J];绵阳师范学院学报;2006年02期 |
|
|
|
|
|
| 1 |
张高华;苏乔;安利佳;;转獐茅AlNHX基因烟草的耐盐生理研究[J];安徽农业科学;2008年18期 |
| 2 |
孙建昌;王兴盛;;水稻耐盐基因工程研究[J];宁夏农林科技;2007年04期 |
| 3 |
杨锦芬;郭振飞;;柱花草SgNCED1基因的克隆及功能分析[J];草地学报;2006年03期 |
| 4 |
何群;;我国首获强杀虫转基因烟草[J];生物学通报;1991年01期 |
| 5 |
张大兵,张景六,王宗阳,洪孟民;人乳铁蛋白基因在烟草中的表达及抗细菌与病毒的能力[J];植物生理学报;1999年03期 |
| 6 |
蓝海燕,张丽华,王兰岚,陈正华,田颖川,陈正华,王长海;表达β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因烟草及其抗真菌病的研究[J];遗传学报;2000年01期 |
| 7 |
黄虎,耿川东,李家大,郝建疆,谢伟军,龚蓁蓁;拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达[J];江苏农业学报;2000年04期 |
| 8 |
倪迪安,于晓红,王凌健,许智宏;iaaM基因在烟草花粉中的表达及其在花粉发育中的作用[J];实验生物学报;2002年01期 |
| 9 |
沙丽娜;郭兆奎;万秀清;程红梅;;转录因子CBF基因转化烟草抗寒性指标的检测[J];中国林副特产;2009年01期 |
| 10 |
龙永彬;;烟草抗病毒基因工程策略[J];民营科技;2009年04期 |
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