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梭梭4个14-3-3蛋白基因的克隆及分析

蒋圆圆  
【摘要】:14-3-3蛋白是生物体内重要的调节蛋白,对细胞代谢及循环、信号传导、转录调节、蛋白跨膜转运、以及生物胁迫和非生物胁迫等多种生理过程均有重要的调节作用。本文以梭梭为研究对象,通过RT-PCR方法从中分离并克隆出4个14-3-3蛋白基因,并对其进行了初步的生物信息学分析。采用半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR方法研究4个基因在梭梭不同组织中的特异性表达以及在干旱胁迫下转录水平的表达,同时利用PEG介导鹰嘴豆原生质体的瞬时表达对4个基因进行亚细胞定位分析。主要研究结果如下:(1)克隆出4个梭梭14-3-3蛋白基因,命名为HaFT-1、HaFT-2、HaFT-3和HaFT-4。4个14-3-3蛋白基因ORF大小为795 bp、792 bp、792 bp、786 bp,编码的氨基酸个数为264、263、263、261。分别对基因HaFT-1、HaFT-2、HaFT-3和HaFT-4编码的氨基酸序列进行生物信息学分析和预测,结果发现,4个蛋白的理化性质相似,都是亲水性、不稳定蛋白,不具有跨膜结构。氨基酸序列同源性比对发现,4个14-3-3蛋白均与甜菜同源性最高,在85%以上。分子进化树显示,HaFT-1和HaFT-3与甜菜、陆地棉聚为一枝;HaFT-2与甜菜、冰花聚为一枝;HaFT-4仅与甜菜单独聚在一起。(2)采用染色体步移法获得梭梭HaFT-3基因5'上游启动子序列,大小为1793 bp,对序列分析表明该启动子中包括响应植物激素、干旱、光、热等多种外界刺激的顺式作用元件,以及与植物生长发育相关的调节元件等。(3)以18S rRNA为内参基因,对4个14-3-3蛋白基因在梭梭的根、同化枝、花和种子四种不同组织中的表达情况进行分析。结果表明,基因HaFT-1在根中表达最强,种子次之;基因HaFT-2和HaFT-4均是在同化枝中表达最强,根的表达量次之;基因HaFT-3在根、同化枝、种子和花的表达量依次降低。利用荧光定量检测HaFT-1、HaFT-2、HaFT-3和HaFT-4在干旱胁迫处理下的表达,HaFT-1在土壤含水量9%时表达量达到最高;HaFT-2在土壤含水量12%时表达量达到最大;HaFT-3和HaFT-4均在含水量3%时表达量达到最大。HaFT-2表达水平相对较低,HaFT-3和HaFT-4表达呈现递增的趋势。(4)成功构建了植物表达载体,分别命名为pCAMBIA1304-Ha FT-1、pCAMBIA1304-HaFT-2、pCAMBIA1304-HaFT-3和pCAMBIA1304-HaFT-4。并将表达载体成功转入鹰嘴豆原生质体进行瞬时表达。结果表明,基因HaFT-1、HaFT-2、HaFT-3和HaFT-4均具有细胞核定位功能。


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