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《新疆农业大学》 2016年
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Paecilomyces sp.FLH 30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因和Selenomonas ruminantium木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达

胡玮  
【摘要】:Pecilomyces sp.FLH 30中的内切β-1,3(4)葡聚糖酶对植物的细胞壁具有降解的功效,可以高效的水解植物细胞壁。Selenomonas ruminantium是反刍动物瘤胃内的一种优势菌,源于Selenomonas ruminantium产生的木糖苷酶在完全降解木聚糖的过程中起着关键作用。本试验以源于拟青霉Pecilomyces sp.FLH 30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因GLUn和源于Selenomonas ruminantium木糖苷酶基因XSAn为研究对象。研究结果如下:对源于Pecilomyces中的葡聚糖酶的密码子的序列进行优化,构建新的载体,试验用Sac I酶切DNA,通过1500 v的电流刺激,将其转导进菌株GS115中,并且在试管水平、摇瓶水平及发酵罐中分别进行表达,酶活性由最初的11.26 IU/mL提高至酶活性259.73 IU/mL。试验中测的重组酶GLUnm的结果显示:在37-50℃的温度内变化较小,在pH为5.0-8.0的范畴内变化不大。同时对地衣多糖(Lichenim)和大麦β-葡聚糖(Barleyβ-glucan)有水解作用,对燕麦木聚糖(Oat spelt xylan)没有水解作用,也不可以水解CMC-Na,该重组酶GLUnm对pNPX也无降解作用。对源于Selenomonas ruminantium木糖苷酶基因XSAn进行优化合成,得到新的木糖苷酶基因XSAnm,构建了重组载体p PIC9K-XSAnm,用Bgl II酶切重组载体pPIC9K-XSAnm,通过电击转化仪1500 v,5 ms的参数下,通过电流刺激,将目的DNA导入GS115中,分三个不同的表达环境对其进行表达,分别在试管中、在摇瓶中,在10 L发酵罐中去表达,重组酶活性由最初的17.54 IU/mL提高至287.61 IU/mL。酶学性质研究结果表明,重组木糖苷酶在pH 5.0-6.0,温度40-55℃的条件下较稳定,对(pNPX)对硝基苯-β-D-木糖苷有降解的作用,对于燕麦木聚糖(Oat spelt xylan)也具有水解的功能,对于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和地衣多糖(Lichenim)以及大麦β-葡聚糖(Barleyβ-glucan)不具有降解的作用,SDS会降低XSAnm的活性,EDTA可以使重组酶XSAnm的活性减弱。当重组酶GLUnm与麦芽汁反应,添加重组酶GLUnm的过滤的速率,很显然较未添加的对照组的麦芽汁的反应速率提高了44.04%;添加重组木糖苷酶反应速率较未添加外源酶的过滤速率提高了25.31%。
【学位授予单位】:新疆农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q55;Q78

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