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《新疆农业大学》 2003年
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口蹄疫病毒VP1基因的克隆表达及细胞因子检测研究

刘进  
【摘要】: 口蹄疫是口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫可以经过多种途径传播,一旦发生则呈暴发流行。家畜患口蹄疫后生产性能急剧下降,对于幼年动物会造成心肌损伤进而发生死亡。由于口蹄疫具有传播途径多、流行范围广、传染力强、病原变异大等的特点。 本论文研究工作主要包括FMDV外壳蛋白VP1基因的克隆、外壳蛋白VP1的原核和真核表达、结构分析和细胞因子基因在体内表达水平的高低,奠定FMDV VP1DNA疫苗的研究基础。 首先,根据已知的FMDV基因序列,设计特异性引物,扩增出FMDV-VP1基因,将克隆到的VP1基因连接到测序载体上后用DNA测序仪对该序列进行测序。通过与GeneBank中所有的VP1序列进行比较我们发现VP1第24、33、204位氨基酸突变幅度最大。研究发现,动物对FMDV的体液免疫呈T细胞依赖性,VP1的 21~40位氨基酸残基是一重要T细胞表位,24与33位等表位的突变使抗原三级结构发生变化有可能使动物免疫系统不能诱发很强的T细胞免疫应答。 第二,为了得到抗原蛋白,将VP1的原核表达质粒pGEX-4t-VP1转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,裂解细胞后用琼脂糖珠进行纯化,用ELISA和WESTERN BLOT 进行检测,结果表明诱导表达出所需大小的融合蛋白。但大肠杆菌表达系统不能对翻译后的产物进行修饰加工,故不能组装完整的VP1抗原,此外如何形成链内链间二硫键并正确折叠也有待解决。 第三,为了克服原核表达系统的局限,将克隆载体上的VP1基因定向克隆到真核表达载体pSuperY-VP1上,酶切鉴定正确的重组质粒大量制备后,将真核重组质粒转入酵母进行真核表达,用WESTERN BOLT进行表达产物的检测。 利用酵母表达系统对VP1进行表达,为FMDV-VP1疫苗研究及疾病的检测提供了足量有生物活性的抗原物质。 第四,DNA 疫苗因其制备简单、使用和保存便利,能构诱导机体产生体液和细胞免疫等优点,成为新一代疫苗研究的热点。在机体对DNA疫苗免疫应答过程中,细胞因子作为免疫调节分子在免疫网络系统中发挥重要的调节功能,研究表明 T细胞通过产生并分泌各种细胞因子来调节免疫反应。为了对免疫前后小鼠脾脏表达的细胞因子的水平进行定量检测,提取小鼠脾脏组织总RNA,经RT反应得到cDNA,利用一种修饰的竞争模板进行竞争PCR扩增,在琼脂糖凝胶电泳分析并与竞争模板产物比较而定量。结果表明能够初步定量免疫前后小鼠体内的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和IFN-γ的表达量,为深入研究基因疫苗免疫前后小鼠体内各种细胞因子的动态水平和分析细胞免疫效果奠定了基础。
【学位授予单位】:新疆农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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