转木霉几丁质酶基因棉花的抗病性检测及鉴定

【摘要】：棉花是我国的主要经济作物,在国民经济中占有重要地位。新疆地处中国的西北边缘,其独特的气候为棉花生长提供了天然的条件与保障。上世纪80 年代,棉花黄萎病在新疆开始零星发生且日趋严重。1999 年的初步调查,北疆棉区40%以上棉田都有黄萎病发生,其中重病田面积大约占播种面积的8%,有些棉田发病率已达30%以上,严重影响了棉花的产量和品质,已成为新疆棉花生产的一大障碍(姚源松,2004)。因此,如何创造抗病棉花新品种或种质材料,是当前棉花生产和棉花育种急需解决的问题之一,尤其是对棉花黄萎病,至今尚无有效的防治措施,主要原因就是缺乏可利用的抗源。利用基因工程技术将外源抗真菌病基因导入棉花,为抗性育种提供了新途径。 本实验通过利用花粉管通道法将构建在植物表达载体pART27 上的抗黄萎病基因木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因导入新疆4 个陆地棉品种(系)中,并对转基因植株进行了检测。试验结果如下: 1.木霉几丁质酶基因的转化 利用花粉管通道法将木霉几丁质酶基因导入新疆陆地棉系9、新陆中15 号、新陆中19 号和T4中,导入花数分别为581 朵、2067 朵、808 朵、238 朵。收获铃数分别为41 个、328 个、47 个、39个。成铃率分别为7%、15.9%、5.8%、16.4%、12.3%。 2.田间卡那霉素检测 将收获的T0和T1代种子1.64kg 全部种于病圃中。出苗4012 株,出苗率为75.2%。2-3 片真叶时,对转导不同标记基因的棉株,分别点涂卡那霉素。卡那霉素溶液浓度为500ppm,点涂3 次后,T2代未变色呈阳性反应的植株共50 株。 3.转基因植株的检测 经酯酶同工酶电泳检测:转木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因植株比对照多一条谱带,表明转化植株与对照相比酯酶同工酶发生改变。 对转基因棉花材料进行PCR 分子生物学检测, 证明卡那霉素抗性植株中外源木霉几丁质酶基因可能已整合到受体植株的基因组中。 取转基因植株的叶片制备粗酶液,通过抑菌效果试验显示:转基因植株抑菌效果比非转基因植株抑菌效果要明显,表明外源基因已在转基因植株中进行表达。 将转基因棉花材料的T2代陆地棉新陆中15 号T、系9T、和感病的新陆中15 号、系9,种植于发病均匀的黄萎病病圃中。进行抗黄萎病性能的鉴定筛选,以收获期剖杆鉴定的维管束的变色程度来计算病情指数,获得T2代具有较高的抗病性植株23 株。转木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因棉花的1 个株系对黄萎病抗性明显提高,为获得抗黄萎病的棉花品种奠定了基础。