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《新疆农业大学》 2005年
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Puroindoines基因反义载体构建和转化及过量表达载体转基因小麦的遗传鉴定

耿洪伟  
【摘要】:籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状。控制硬度的主效基因Pina 和Pinb 位于染色体5D 短臂上,软质对硬质为显性。当Pina 和Pinb 为野生型时(Pina-D1a 和Pinb-D1a),小麦籽粒为软质;当Pina 基因不表达(Pinb-D1a)或Pinb 基因发生突变时(Pinb-D1),小麦籽粒则表现为硬质。本研究目的是通过转基因技术,进一步明确Pina 和Pinb 的功能,并为将来通过基因工程方法快速改良我国现有小麦优良品种的籽粒硬度奠定基础。 利用含有Ubi 启动子、Bar 表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pina、Pinb 基因的植物反义表达载体pAHantipA 和pAHantipB,其中pAHantipA 和pAHantipB 分别载有小麦籽粒硬度Pina、Pinb 基因的反向序列,可用于小麦遗传转化。利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411(Pina-D1a 和Pinb-D1a)中,分别获得转基因植株9 株和5 株,T1代转基因植株的抗性筛选及PCR检测结果表明,转化率分别为1.4%和0.9%。基因组DNA 斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合。 利用花粉管通道法,分别将含有Pina 和Pinb 基因的植物高效表达载体pUBPa 和pUBPb 导入小麦品种中优9507(Pinb-D1b),获得转基因植株。抗性筛选及分子检测分别证实外源Pina、Pinb基因的整合。T1代转基因植株的抗性筛选及PCR 检测结果表明,两个基因的转化频率分别为2.2%和2.0%。对T2代转基因植株的抗性筛选及分子检测结果进行遗传鉴定,确定了两个稳定纯合株系。Friabilin 蛋白检测表明,Puroindolines 基因已在蛋白水平上成功表达,受体植株籽粒硬度表现不尽相同。
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