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《新疆农业大学》 2005年
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雌二醇单克隆抗体的制备与酶联免疫检测试剂盒的初步研究

戴小华  
【摘要】:为建立雌二醇(estradiol, E2)在畜产品中残留的快速检测方法,本研究从完全抗原的制备着手,采用碳化二亚胺法制备E2免疫原,免疫BALB/c 小鼠,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)对抗体效价进行检测,利用杂交瘤技术筛选稳定分泌E2的单克隆抗体,用过碘酸钠氧化法制备酶标雌二醇抗原(E2-BSA-HRP)和酶标雌二醇抗体(1E3-HRP),用方阵滴定法确定包被原最适工作浓度及单抗最适稀释倍数。最终对用于检测雌二醇残留的三种酶联免疫检测方法(酶标抗原直接竞争法、酶标抗体直接抑制法、双抗夹心法)进行了筛选。实验结果为:E2抗血清效价为1∶3.2×104。利用杂交瘤技术获得了两株稳定分泌E2单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和1B4,经鉴定1E3细胞株分泌的单克隆抗体为IgG2b 亚型,1B4 细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1 亚型;杂交瘤细胞染色体数目为92~102 条;间接ELISA 测定腹水效价为1∶1×105,其亲和常数为2.9×108L/mol。1E3单克隆抗体的分子量为179KD,其中轻链分子量为28KD,重链分子量为61.2KD。该单抗与雌三醇、雌酮和孕酮交叉反应率均小于0.5%。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。用方阵滴定法确定包被原最适工作浓度为0.625 μg/ml,单抗最适稀释倍数为1∶1000,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(酶标二抗)最适稀释倍数为l∶5000。采用间接竞争ELISA 方法建立检测E2的标准曲线,在0.01 ng/ml~1μg/ml 之间,呈良好的线性相关,线性回归方程为:y = -8.201x + 47.814,R2 = 0.9965。以抑制率为50%时对应的浓度计算,该方法对E2的检测限为0.54 ng/ml。通过比较三种ELISA 方法,从中选出了试剂盒的检测方法为酶标抗原直接竞争法。
【学位授予单位】:新疆农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S859.84

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