新疆盐生植物灰绿藜NHX1基因转化新疆大叶苜蓿植株再生及分子检测的研究

【摘要】： 随着植物抗逆性研究和植物转基因技术的发展,通过异源目的基因转化培育耐盐碱苜蓿品种的研究已引起人们的关注,植物离体高频再生体系的建立是异源目的基因转化高效的基础。选取新疆大叶紫花苜蓿(Medicago sativa.L)种子萌发5-7d无菌苗的子叶、下胚轴及根为外植体,诱导愈伤组织的培养基为MS+2,4-D 0.1-3.0 mg/L(8种不同水平)或MS+2,4-D 2.0 mg/L+ KT 0.01-0.5 mg/L(10种不同水平);由愈伤组织诱导芽的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L,生根培养基为MS。结果表明,外植体在MS+2,4-D 2.0 mg/L+ KT 0.2 mg/L培养基中能够产生状态较好可再分化的愈伤组织,子叶、下胚轴、根的平均出愈率分别为93.1%、100%、100%。愈伤组织在MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L培养基中培养40-80d中均可分化出不定芽,子叶、下胚轴、根来源的芽分化率最高分别为50%、78%、50%,将高度在2 cm以上的芽转入MS培养基中诱导生根,14d后,生根的试管苗炼苗移入花土中,成活率达90%以上。子叶、下胚轴、根在该体系中均能获得再生植株,根也是一种较好的植株再生材料,以根为外植体进行植株再生的研究报道还较少。 卡那霉素的浓度会影响植物遗传转化阳性植株的筛选。选取新疆大叶紫花苜蓿5-7d无菌实生苗的子叶、下胚轴、根分别接入培养基MS+2,4-D2mg/L+KT0.2mg/L+卡那霉素30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L中,在愈伤组织的诱导过程中进行卡那霉素敏感试验,第10d的平均出愈率结果表明,子叶在40mg/L卡那霉素浓度时的出愈率为14.82%,50mg/L的为0%;下胚轴和根在本实验的卡那霉素浓度范围内的平均出愈率均可达到90%-100%。子叶对卡那霉素的敏感性较下胚轴和根的强,进行植物遗传转化时选择子叶为外植体,其卡那霉素筛选浓度确定为40mg/L-50mg/L。 利用转基因技术能够快速有效地获得抗盐碱苜蓿的新品种,但苜蓿的品种直接影响着其再生能力和遗传转化,因此建立农杆菌介导的大叶苜蓿转基因体系对于大叶苜蓿抗逆新品种培育具有重要的促进作用。将新疆盐生植物灰绿藜(Chenopodium glaucum Linn.)的Na+/H+反向运输体基因Cg-NHX1构建到植物表达载体pBIN438上,并转入根瘤农杆菌EHA105,以5-7d苗龄的新疆大叶紫花苜蓿(Medicago.sativa)子叶为转化受体,通过重组EHA105介导的子叶浸染法将Cg-NHX1基因导入新疆大叶紫花苜蓿子叶中,获得了抗卡那霉素的再生植株。提取转基因植株基因组DNA,进行PCR检测和Southern blot分析,结果表明Cg-NHX1基因已经被整合到新疆大叶紫花苜蓿基因组中。本研究成功地获得灰绿藜NHX1基因转化的新疆大叶紫花苜蓿植株,并在新疆大叶紫花苜蓿遗传转化影响因素的研究中,发现菌液浓度OD600nm为0.2～0.3,浸染时间20min适宜于子叶愈伤组织诱导,有利于基因转化植株的获得。 盐份含量会抑制植物种子的萌发和植株的生长。选取籽粒饱满的新疆大叶紫花苜蓿种子,经表面无菌处理后,接入培养基MS+NaCl0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L的MS固体培养基中进行种子萌发和植株生长实验。结果表明,第15d时200mmol/L NaCl中的种子平均萌发率为23.3%,300mmol/L中的为0%,萌发植株经过60d的生长,100mmol/LNaCl中的小植株的生长已经被明显的抑制。