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《新疆农业大学》 2007年
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鹅H5亚型禽流感病毒HA1-iELISA抗体检测技术研究

颜焰  
【摘要】: 禽流感(Avian Influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的禽类烈性传染病,可感染多种动物和人,是一种重要的人畜共患病病原。为预防和控制AIV,对天然储存宿主——水禽进行长期监测,具有重要的生态学和公共卫生学意义。 本研究以H5N1亚型AIV为对象,在已构建的pETHA1-H5的基础上,进行HA1蛋白的原核表达研究。将pETHA1-H5转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导,实现了重组H5亚型HA1蛋白的表达,并以包含体形式存在。HA1重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,1 L培养物能获22.75 mg。Western-blot和Dot-ELISA分析表明HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,而与其他禽类病毒血清无交叉反应性,证明了HA1重组蛋白具有良好的免疫反应性。 采用纯化的重组H5亚型AIV血凝素(HA1)蛋白为检测抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鹅IgG为二抗,建立了H5亚型禽流感病毒血凝素间接酶联免疫吸附试验检测技术(HA1-iELISA)。通过优化试验确定了最佳工作条件:抗原包被浓度为2μg/ml,37℃作用1 h后,4℃放置12 h,血清和酶标抗体作1:100倍、1:1000倍稀释,以0.05 M pH8.5的Tris-HCl缓冲液为包被液,5%脱脂奶/PBS为封闭液,0.1%BSA/PBS为稀释液,血清与酶标抗体的最佳反应条件为37℃孵育45 min,底物显色条件为室温5-10 min。参考HI结果,对417份鹅血清的HA1-iELISA S/P值进行ROC分析,确定以0.25为阴阳性血清临界值,此时诊断敏感性和特异性分别为91.15%、91.1%。交叉试验表明重组HA1抗原不与其它水禽类易感病毒血清反应,有较强的抗原特异性。此法稳定性和重复性较好的,批内、批间变异系数能控制在12%以内。采用HI、VN和全病毒-ELISA和HA1-iELISA方法对100份鹅血清进行检测,结果显示HA1-iELISA与其它三种方法的符合率为90%左右,有较高的敏感性和特异性,表明此法适用于临床免疫鹅群H5亚型AIV抗体的监测。 为开发出保存期长、稳定可靠的HA1-iELISA试剂盒,对盒内各成分的溶液环境、存放条件进行试验。结果表明,经真空干燥处理的酶标板在低温保存条件下可保持良好的抗原活性;各工作溶液在添加保护剂和稳定剂后保存时间明显提高;以上述组成成分最短保存时间为界组装的HA1-iELISA试剂盒在4℃条件下可保存时间为6个月。本研究所建立的快速、特异的HA1-iELISA方法适用于H5亚型AIV抗体的血清学诊断,并为进一步商业试剂盒的研制提供基础。
【学位授予单位】:新疆农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S854.43

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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