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《石河子大学》 2009年
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羊种布鲁氏菌感染胚胎滋养层细胞的分子机制研究

张辉  
【摘要】:布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一类动物源性人兽共患病,在世界范围内广泛流行,尤其是发展中国家。近几年回升势头迅猛,引起了世界范围的广泛关注,为此,我国紧急发布了《关于加强布鲁氏菌防治工作的通知》。布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生致病菌,侵袭力强、传染途径多,人感染后呈持续性感染,目前尚无法根治;家畜感染后主要引发母畜流产,给畜牧业生产造成严重损失。动物胎盘中含有大量的赤藓醇,能够促进布鲁氏菌的生长,布鲁氏菌对胎盘具有显著的亲嗜性,胚胎滋养细胞是母体和胎儿的联系纽带,同时也是布鲁氏菌感染的靶细胞,一旦受到损伤,就会导致流产,但引发流产的分子机制还不清楚。为此,本研究以布鲁氏菌和胚胎滋养层细胞为研究对象,主要展开以下的研究工作: 1.羊种布鲁氏菌的分离鉴定及ELISA检测方法的建立。通过采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验对分离培养的菌株进行鉴定,获得了羊种布鲁氏菌生物3型1株,命名为027株,对其SP41基因进行克隆、表达、纯化,包被酶标反应板并进行样本检测。结果布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的最优条件是重组蛋白SP41最佳抗原包被浓度为0.6μg/mL,最佳血清稀释度为1:50,该方法重复性好、特异性强,样本阳性检出率高于虎红平板试验和试管凝集试验。 2.羊种布鲁氏菌ery操纵子在感染人胚胎滋养层细胞HPT-8过程中的表达调控。采用实时定量PCR方法检测了布鲁氏菌侵染HPT-8细胞过程中ery操纵子4个基因在未侵染、侵染20min、1h、2h、3h、4h时的表达差异,结果ery操纵子在侵染前后的表达有明显差异,eryA、eryB、eryC相对表达量在侵染2h时表达量最高,eryD在3h时的相对表达量最高,其余状态下的表达量都很低,并且随着eryD表达量升高,eryA、eryB、eryC的表达量降低。 3.建立羊种布鲁氏菌027株侵染HPT-8细胞的cDNA文库。分别提取布鲁氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8细胞总RNA,逆转录合成cDNA,同源重组法构建布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,并对部分EST进行测序分析,结果羊种布鲁氏菌027株侵染人滋养层cDNA文库的库容为1.43×106,重组率为96.92%,插入片段大小在0.2-5kb;对文库63个克隆进行测序,用BlastX和BlastN进行序列同源性比对,并将63个基因进行了功能分类。然后,构建pGBKT7-omp25诱饵质粒,转化酵母Y187,结果表明诱饵菌无自激活活性、无毒性。 4.筛选并验证与布鲁氏菌流产相关因子互作的HPT-8细胞靶蛋白。采用酵母双杂交技术筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25互作的HPT-8细胞捕获蛋白,并采用免疫共沉淀技术验证互作的蛋白。共筛选出了7个与布鲁氏菌OMP25诱饵蛋白相结合阳性捕获蛋白,验证试验表明布鲁氏菌外膜蛋白OMP25与HPT-8细胞的Ferritin、hypothetical LOC339123蛋白发生了相互作用。 5.分析捕获蛋白在布鲁氏菌侵染HPT-8细胞过程中的作用。根据铁蛋白、hypothetical LOC339123蛋白核苷酸序列,分别构建了3个特异性shRNA干扰载体,转染HPT-8细胞,实时定量PCR检测2个基因的表达水平,检验其干扰效率;采用布鲁氏菌感染转染shRNA干扰载体前、后的HPT-8细胞,检测布鲁氏菌的相对数量。结果针对铁蛋白、hypothetical LOC339123合成的shRNA干扰片段与各自的混合组的干扰效果基本一致,Ferritin混合组的干扰抑制率为76.18%, hypothetical LOC339123混合组的干扰抑制率为71.11%。针对铁蛋白的干扰载体混合组转染前后,布鲁氏菌相对数量差异较大,而hypotheticalLOC339123的差异不明显。 以上研究结果表明,分离培养的布鲁氏菌027株为羊种布鲁氏菌生物3型;成功构建了基于重组蛋白SP41的布鲁氏菌病间接ELISA检测方法;布鲁氏菌感染HPT-8细胞过程中ery操纵子4个基因在不同时间点表达存在着差异;成功构建了羊种布鲁氏菌027株侵染HPT-8细胞的cDNA文库;布鲁氏菌OMP25蛋白与HPT-8细胞的Ferritin、hypothetical LOC339123发生了相互作用,Ferritin与布鲁氏菌感染相关,hypothetical LOC339123与布鲁氏菌感染不相关。通过本研究,为揭示布鲁氏菌引发流产的分子机制提供线索,也为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S858.26

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 孟仁;陈创夫;张辉;王远志;郭飞;鲁芝子;李瑞芳;;布鲁氏菌2308ery基因启动子缺失株的构建及鉴定[J];生物技术;2012年02期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 张沾;布鲁氏菌Omp25对胚胎滋养层细胞炎性机制初步研究[D];石河子大学;2011年
2 李臻;羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株bp26基因突变株的构建及其免疫原性研究[D];石河子大学;2011年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张辉;陈创夫;唐莉娟;徐军;唐利艳;郭飞;张红星;;布鲁氏菌病病原快速诊断方法建立及应用[J];塔里木大学学报;2008年03期
2 ;卫生部、农业部关于加强布鲁氏菌病防治工作的通知[J];中华人民共和国卫生部公报;2008年01期
3 莫合塔尔,杨荣和,热孜完古丽,陈维伟,石保新,韩雄杰,买地尼牙提;塔里木马鹿布氏杆菌病诊断及调查[J];新疆畜牧业;2002年03期
4 王丽;1952~2003年陕西省检出布鲁氏菌特性分析[J];中国地方病学杂志;2004年06期
5 曾鹏武,李灵,陈胜文;天山马鹿布鲁氏菌病的检疫和防制[J];中国兽医科技;2004年01期
6 邱昌庆,曹小安,杨春华,周继章,高双娣,程淑敏;乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究[J];中国兽医科技;2005年02期
7 王远志;陈创夫;崔步云;张辉;盛金良;曹旭东;李有文;杨冬梅;;羊种布鲁氏菌生物3型的分离和鉴定[J];中国预防兽医学报;2007年10期
8 尚德秋;中国布鲁氏菌病防治科研50年[J];中华流行病学杂志;2000年01期
9 王鑫 ,赵宝珍 ,徐彦霞;羊种布鲁氏菌心内膜炎一例[J];中华流行病学杂志;2003年04期
10 赵忠鹏;吴朔;罗德炎;王希良;祝庆余;;羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M的比较蛋白质组学研究[J];中国人兽共患病学报;2007年12期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张高轩,张银国,沈文,王鹏雁;传染性附睾炎公羊精液临床病理学研究[J];石河子大学学报(自然科学版);2001年01期
2 唐利燕;陈创夫;王远志;张辉;张红星;;布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立[J];石河子大学学报(自然科学版);2009年04期
3 马超;马兵钢;郝青南;何娟;王蕾;;番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化[J];石河子大学学报(自然科学版);2010年01期
4 杜军伟;王远志;陈创夫;葛阳春;;铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响[J];石河子大学学报(自然科学版);2010年05期
5 张俊辉;杨超;叶运莉;;我国人间布鲁菌病流行特征变化及防控策略[J];寄生虫病与感染性疾病;2011年02期
6 杨梅;宋尔卫;;小分子RNA与肿瘤治疗[J];生命科学;2008年02期
7 姚燕丹;宋尔卫;;RNA干扰体内导入技术研究进展[J];生命科学;2010年07期
8 谭逵;张琼;范久波;谢荣华;蒋立平;官剑武;舒衡平;吴翔;;弓形虫基因缺陷虫株建立方法的初步研究[J];现代生物医学进展;2008年06期
9 刘建功;王江涛;解军;;RNA干扰技术对PC12细胞CaMKⅡβ基因表达的影响[J];中国生物工程杂志;2008年02期
10 刘辉;陈创夫;韩亚杰;董玲;;新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因的克隆与序列分析[J];生物技术;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 陈海;李春辉;朱兰兰;杨小敏;黎海文;;感染性心内膜炎患者血液中分离到羊种布鲁菌[A];2009年海南省微生物学检测及质量保证研讨会论文集[C];2009年
2 王金良;沈志强;曲光刚;唐娜;刘吉山;李峰;管宇;;布氏杆菌病研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
3 王远志;陈创夫;张辉;唐丽娟;唐丽燕;张红星;郭飞;;绵羊种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
4 张辉;陈创夫;王远志;盛金良;任艳;郭飞;;羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
5 吴斌;王玫;王长文;刘霞;;布鲁氏菌分子生物学快速检测技术的研究[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
6 李秋丽;夏蔚;张彤;;利用统计方法分析布鲁氏菌病的流行特征[A];中国现场统计研究会第十三届学术年会论文集[C];2007年
7 谢芝勋;谢志勤;刘加波;庞耀珊;邓显文;唐小飞;温娟;;多重PCR快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌的研究与应用[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
8 张太翔;凌宗帅;赵立娜;孙涛;徐彪;梁成珠;刘文鹏;孙军;张艺兵;;基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年
9 张太翔;凌宗帅;赵立娜;孙涛;徐彪;梁成珠;刘文鹏;孙军;张艺兵;;基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨艳玲;羊布鲁氏菌蛋白质组学分析及免疫候选抗原的筛选与鉴定[D];吉林大学;2011年
2 王方昆;马耳他型布氏杆菌弱毒疫苗株M5-90致弱分子机制的研究[D];中国农业科学院;2011年
3 刘文兴;布鲁氏菌标记疫苗(M5-90-26)的鉴别诊断及其bp26蛋白的免疫原性分析[D];南京农业大学;2011年
4 赵征;牙胚发育中ADAM28基因的克隆、表达和功能研究[D];第四军医大学;2006年
5 周霞;肠球菌性羔羊脑炎的发现及其病原特性和诊断方法研究[D];四川农业大学;2007年
6 徐哲;TLR4 siRNA防治D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤的实验研究[D];第四军医大学;2007年
7 钟文昭;中国NSCLC人群EGFR-TKI治疗预测因子及EGFR下游信号通路机制研究[D];中山大学;2007年
8 余莉;利用RNA干扰技术双通道抑制弓形虫嘌呤补救合成途径[D];安徽医科大学;2008年
9 王海燕;应用RNAi技术抑制猪圆环病毒2型的复制和表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的杆状病毒的免疫保护作用[D];扬州大学;2008年
10 谭晶;靶向hTERT基因的siRNA治疗胰腺癌的实验研究[D];昆明医学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘新军;表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立[D];华中农业大学;2010年
2 李博;布鲁氏菌PCR检测方法的应用与分子分型研究[D];新疆农业大学;2010年
3 张逸凡;甜菜夜蛾嗅觉受体Sexi\Orco基因表达谱与RNA干扰研究[D];山东农业大学;2011年
4 马琳;人布鲁杆菌病的随访调查和诊断方法研究[D];吉林大学;2011年
5 孙春辉;羊布鲁氏菌16M感染巨噬细胞膜蛋白质组学研究[D];吉林大学;2011年
6 马涛;LV-shCaV2.2e37a转染原代背根神经节神经元细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
7 刘景福;布鲁菌新型亚单位疫苗BP26的动物免疫评价[D];福建医科大学;2011年
8 狄栋栋;犬布氏杆菌分离鉴定及omp25基因分析[D];内蒙古农业大学;2011年
9 崔婷婷;靶向MRP1基因RNAi逆转肺癌A549/DDP细胞多药耐药研究[D];齐齐哈尔大学;2011年
10 陈丹;辽西地区职业人群布鲁氏菌病知识及行为干预研究[D];辽宁医学院;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 季晶晶;李槿年;;拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计[J];水生态学杂志;2008年05期
2 刘惠莉;邢继兰;潘洁;杨秋峰;赵艳敏;;猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析[J];生物工程学报;2008年04期
3 唐利燕;陈创夫;王远志;张辉;张红星;;布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立[J];石河子大学学报(自然科学版);2009年04期
4 李海侠;毛旭虎;;蛋白质抗原表位研究进展[J];微生物学免疫学进展;2007年01期
5 汪舟佳;甄清;乔凤;王玉飞;杜昕颖;钟志军;赵瑾;于雅琴;黄留玉;孙岩松;陈泽良;;布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立[J];微生物学报;2009年03期
6 李臻;张红星;唐利燕;陈创夫;王远志;;布鲁氏菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株的构建及鉴定[J];微生物学报;2010年12期
7 刘辉,姚咏明;细胞内炎症信号通路交汇作用研究进展[J];中国病理生理杂志;2005年08期
8 高永辉;张松乐;曾政;罗德炎;张良艳;董梅;王希良;;布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察[J];中国地方病学杂志;2006年01期
9 潘文;王佳莹;赵明秋;琚春梅;易琳;常艳;虞红娇;陈金顶;;布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建[J];中国兽医科学;2011年03期
10 贺松;张德纯;;基因敲除方法及其应用[J];中国微生态学杂志;2009年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 王远志;绵羊种布鲁氏菌致病的分子机制研究[D];石河子大学;2008年
2 胡森;马耳他布鲁氏菌M5-90 bp26基因缺失疫苗株的构建及安全性和免疫原性评估[D];东北农业大学;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 高维凡,宋世勇,韩露,杜绍范,李义,宁志利;应用酶联免疫吸附测定检测鸡血液中抗新城疫病毒抗体的动力学研究[J];沈阳农业大学学报;1997年03期
2 莫合塔尔,杨荣和,热孜完古丽,陈维伟,石保新,韩雄杰,买地尼牙提;塔里木马鹿布氏杆菌病诊断及调查[J];新疆畜牧业;2002年03期
3 冯培忠,苏城,黄建;病绵羊体内分离的拟似绵羊附睾种布氏菌的首次系统鉴定与分类[J];畜牧兽医学报;1997年03期
4 张建斌,王树慧,冯向光;长治市布鲁氏菌病50年流行状况分析[J];中国地方病学杂志;2002年04期
5 王萍,师艾生,李建武;礼泉县布鲁氏菌病爆发的流行病学调查分析[J];中国地方病学杂志;2003年04期
6 杨建国,赵妮,李秀婷,翟国军,赵明,张英环;1995-2002年郑州市全国布鲁氏菌病监测点监测结果分析[J];中国地方病学杂志;2003年06期
7 张彤,费春楠,李颖;1998~2002年牡丹江市布鲁氏菌病监测结果分析[J];中国地方病学杂志;2004年01期
8 姬凤阳,任斌强,李国栋,饶金,马爱芳;建国以来延安市布鲁氏菌病防治回顾[J];中国地方病学杂志;2004年03期
9 曹洪敬,王文志,崔锦鹏,任素芳,颜世敢,徐学孟,沈冰,秦良勇;Dot-ELISA间接法检测鸡新城疫病毒(NDV)的研究[J];中国动物检疫;1998年06期
10 曾鹏武,李灵,陈胜文;天山马鹿布鲁氏菌病的检疫和防制[J];中国兽医科技;2004年01期
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