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枯草杆菌脂肪酶固定化催化生产生物柴油的研究

李景全  
【摘要】:目的:将枯草杆菌脂肪酶分泌菌株产生的脂肪酶固定在人造沸石上,考察该固定方法的可行性,并对固定化酶的催化能力和催化条件进行系统评估;对固定化酶催化合成生物柴油的工艺进行探讨,考察各影响因素对酯化率的影响,并通过正交试验确定最佳转酯反应条件,以增加脂肪酶的利用率和催化效果,为实际运用固定化酶催化生产生物柴油提供实验依据。 方法:本研究以枯草杆菌表达菌株产生的脂肪酶为材料,通过酶的粗分离后,采用交联-吸附法将脂肪酶固定在人造沸石上,使用p-NPP法通过单因素实验和正交实验设计,确定发挥该酶最大酶活的条件。以橄榄油作为催化底物,碳酸二甲酯为酰基供体使用该固定化酶催化制备生物柴油,考察了酶用量、醇油摩尔比、含水量、催化温度、催化时间,以及不同的催化底物对催化过程的影响;建立正交试验设计方案,采用高效液相色谱检测法检测转化率的变化情况,运用单因素实验和正交实验优化酯交换工艺条件,定性、定量分析固定化酶催化生产生物柴油的最佳条件。 结果: 1.采用交联-吸附法固定枯草杆菌脂肪酶。使用硫酸铵分级沉淀法提取脂肪酶,通过实验证实,以人造沸石作为酶的载体,戊二醛浓度3%时能达到最好的固定化效果。测得酶动力学常数Km=12.5μmol/L, Vmax=1.896μmol/ml/min。 2.固定化酶酶学特性测定。对固定化脂肪酶和游离脂肪酶的温度、pH值、热稳定性、操作稳定性进行比较,结果表明固定化酶最佳反应温度为40-C,相对与游离酶提高5-C,最佳反应pH值为8.0,比游离酶提高0.5;热稳定性明显增强。连续反应5个批次后酶活剩余78%。 3.采用正交试验分析,结果表明在温度50℃,pH8.0,反应时间45min的条件下,固定化酶能够发挥最高的酶活性。 4.使用固定化酶进行酶催化法制备生物柴油。HPLC作为测定酯化率的检测方法,确定固定化酶的酯交换优化条件为:醇油比4:1,酶用量为0.1g/g·oil,反应温度50℃,反应时间24h,再此条件下,酯化反应的转化率达到41.5%。 结论: 1.以人造沸石为载体戊二醛为交联剂的交联吸附法固定枯草杆菌脂肪酶是有效、可行的固定化方法。 2.通过对酶学特性的测定,认为固定后枯草杆菌脂肪酶的热稳定性和pH稳定性均得到提高,并可重复使用,表现出了固定化酶的优势,符合制备固定化酶的目的。 3.采用酶催化法合成出了生物柴油,用薄层层析法和高效液相色谱分析法可对产物进行定性定量分析,确定本方法确实可用于生物柴油的生产。 4.利用单因素实验和正交试验,可以系统的考察影响固定化酶制备生物柴油的主要因素,并能够完成反应条件的优化,是有效的分析方法。


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