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油菜(Brassica napus)miRNA的鉴定及Bna-miR1140表达调控机制研究

董云  
【摘要】:miRNAs(microRNA)是一类在进化上保守的长约21nt的非编码单链RNA,在基因表达调控的网络中处于核心位置,高效的调控其靶基因的翻译或表达,在生物体生长发育、抵抗生物或者非生物胁迫以及在生物体代谢途径中起着非常重要的作用。在短短的10年时间内,植物miRNAs的研究取得了突飞猛进的成果,成为一个新的研究领域。油菜(rape or rapeseed)作为世界性的重要油料作物,研究其miRNA所参与的遗传控制机理,对于培育理想油菜品种,增加油菜产量和降低油菜生产成本具有重要意义。 鉴于目前对油菜miRNAs及其靶基因的研究报道还很少,且sanger数据库中可参考的miRNAs信息也仅仅48条,本研究对甘蓝型油菜(Brassica napus)栽培种Westar材料进行小RNA测序及降解组分析,鉴定新的油菜miRNAs,寻找已知miRNAs和新发现的miRNAs的靶基因,并对芸薹属独特的miRNA家族Bna-miR1140进行表达调控机制研究,以期为油菜品种改良和油菜miRNAs调控机制的研究提供理论依据。 主要结果如下: 1.鉴定获得了41个新的保守油菜miRNAs以及67个芸薹属特有的新候选miRNAs,其中包括20个miRNAs*序列。利用实时荧光定量RT-PCR技术验证了测序结果。并将新发现的miRNAs提交miRBase数据库。 2.依据NCBI中现有的油菜EST和基因组数据,利用targetfinder软件预测了油菜miRNAs靶基因,分别获得保守的miRNAs和特异的新候选miRNAs靶向的基因113个和84个。其中Bna-miR1140的潜在靶基因为一种糖基转移酶(glycosyltransferase)和响应调节因子(Arabidopsis response regulator ARR8-likeprotein)。 3.克隆得到了油菜Bna-miR1140基因前体197bp的片段,构建了植物过表达载体35S::Bna-miR1140,通过农杆菌介导法浸染油菜子叶柄转化甘蓝型油菜栽培种Westar。获得了14个PCR阳性植株,其中有5株株型特异,表现双主序表型,分枝数明显增多,其他9株阳性株均与野生型油菜表型一致,推测可能与表达强度有关。调查了株型特异的5个株系T1代表型分离情况,经卡方检验发现其中有4个株系的株型变异遗传符合3:1的孟德尔分离规律。初步推测油菜Bna-miR1140可能参与调控了油菜的分枝发育。 4.分离得到了油菜Bna-miR1140基因上游1351bp的序列,利用plantCARE在线软件对启动子序列的顺式作用元件进行在线分析,该启动子含有与转录必需的RNA聚合酶结合的TATA盒以及在调控基因转录效率中发挥重要作用的CAAT盒,并进一步构建了miR1140pro::GUS植物表达载体。通过农杆菌介导法转化油菜,得到5株PCR阳性植株,对转基因植株的根、茎、叶、叶腋(茎尖分生组织,SAM)、叶柄、花、种荚等组织和器官进行GUS染色分析,结果表明GUS仅在叶柄及叶腋中表达,这与Bna-miR1140体内表达的结果一致,进一步佐证了Bnas-miR1140与调控油菜的分枝发育相关。 综上所述,本研究采用深度测序和降解组分析技术鉴定了一批油菜的miRNA,并对其靶基因进行了分析和预测。对油菜特有的小RNABna-miR1140进行了较深入的研究,转基因结果初步表明miR1140参与了油菜分枝的发育。


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