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棉田土壤中Verticillium dahliae.Kleb.定量检测

罗舒文  
【摘要】:由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae.Kleb.)引起的棉花黄萎病是典型的土传真菌病害,是世界棉花上重要的病害之一,它产生的休眠体结构在土壤中能够存活十年甚至更久,也是病害初侵染的主要来源。本研究运用选择性培养基平板计数法对棉田土壤中微菌核进行检测,探明棉花黄萎病菌微菌核在土壤中的主要存在位置,以及棉花生长季节病原菌在棉田土壤中的动态变化过程,查明土壤中病原菌的密度与田间病害发生之间的关系。通过特异性引物PCR和环介导等温扩增技术以及环介导等温实时荧光定量扩增检测技术,建立土壤中棉花黄萎病菌微菌核的分子检测方法。筛选出灵敏度高、特异性好、重复性好的体系,并且利用该体系能够准确、快速的定量检测出土壤中棉花黄萎病菌微菌核的量,从而对棉花黄萎病的发生流行以及风险评估提供理论依据。快速、准确的检测出土壤中棉花黄萎病菌微菌核的数量是对棉花黄萎病发生程度预测预防的基础。论文主要研究结果如下:1.应用选择性培养基法结果查明,人工培养的微菌核在MSEA选择性培养基上培养5d的萌芽率可达88%。棉田土壤中微菌核主要存在于0~20 cm的耕作层中,土壤中微菌核的数量与棉花的生长季节有一定的相关性,苗期棉田土壤中的微菌核数量相对较低,结铃盛期土壤中微菌核的数量达到最高值。棉花黄萎病的发病率和病情指数均与土壤中的微菌核数量具有一定的相关性,它们之间均呈极显著的正相关关系(P0.01),发病率和病情指数与土壤微菌核数量之间的相关关系分别为R=0.774和R=0.962,决定系数分别为R~2=0.9041和R~2=0.9237,所建立的预测方程分别为:Y=0.3295X-0.3923和Y=0.3259X+4.4439。即棉花黄萎病越严重,土壤中微菌核数量就多;同时,不同抗病性品种对微菌核在土壤中的积累量也有一定的相关性,品种的抗病性越低,土壤中积累的微菌核数量越多。2.优化了对Verticillium dahliae.进行特异性检测的环介导等温扩增体系,优化的反应条件为:dNTPs 0.6 mmol/L、Mg~(2+)2 mmol/L、甜菜碱0.8 mmol/L、内外引物比为12:1、反应时间为50 min、反应温度为65℃,验证了该体系灵敏度比特异性引物PCR检测灵敏度高10倍,并且操作方便。3.环介导等温扩增与实时荧光定量技术相结合,建立了检测Verticillium dahliae定量扩增方法,绘制了环介导等温实时荧光定量扩增反应的标准曲线,回归方程为:Y=-3.7817X+43.156,相关系数R=0.955,决定系数R~2=0.9968;对其特异性进行评价,所测得五个样品的棉花黄萎病均出现扩增信号,且其产物熔解温度为86℃±0.5℃,无引物二聚体的干扰;对其灵敏度进行评价,其检测灵敏度达5.8×10~1个/g土,比特异性引物PCR检测值高10倍;对其重复性进行评价,三次重复变化不大、变异系数小的重复性好的特点。4.利用环介导等温扩增实时荧光定量技术,对不同发病程度的棉花黄萎病与土壤中棉花黄萎病菌微菌核密度之间的关系进行了讨论。结果发现,棉花黄萎病菌微菌核密度与病情指数存在线性关系,其线性方程为:Y=0.3713X+8.3322,相关系数R=0.964,决定系数R~2=0.9247,但其病情指数与Ct值存在着负线性关系,所得线性方程为:Y=-0.1078X+15.627,相关系数R=0.974,决定系数R~2=0.9482。通过分析其相关性进一步说明荧光定量Ct值与微菌核密度、病情指数之间成反比,即荧光定量Ct值越大,微菌核密度就越小,病情指数就小。对不同发病程度进行配对样本的T检验,与选择性培养基法的结果进行对比,两者结果相同土壤中微菌核数量均存在显著性差异,但环介导等温实时荧光定量检测出的t值和平均值大于选择性培养基法的t值和平均值,可信度和灵敏度高。


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