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《石河子大学》 2018年
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Myostatin DNA疫苗及前肽蛋白免疫动物对肌肉生长的影响

杜玮  
【摘要】:Myostatin,肌肉生长抑制素,是肌肉生长发育的抑制因子。本研究针对Myostatin前肽和成熟肽分别制备拮抗剂与疫苗,从细胞和动物个体水平验证这两种生物制剂对绵羊骨骼肌发育的影响。主要研究内容及结果如下:1.绵羊Myostatin前肽对成肌细胞分化的作用。构建和包装Myostatin前肽过表达慢病毒载体,制备慢病毒,分别用慢病毒感染C2C12细胞,检测Myostatin前肽对C2C12细胞分化的影响。结果对照组和试验组肌管融合率分别为5.62%和9.38%,试验组的肌管融合率显著高于对照组(P0.05)。结果表明Myostatin前肽基因的过表达可能抑制了Myostatin,从而促进了肌管的形成。2.Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达。根据毕赤酵母密码子的偏嗜性及Myostatin前肽蛋白特定位点突变后生物学活性增强的特性,完成对羊Myostatin前肽基因序列的密码子优化,并将第76位的天冬氨酸(Asp)突变成丙氨酸(Ala)。将修饰后的Myostatin前肽基因克隆至酵母表达载体pPIC9K,构建酵母表达重组质粒pPIC9K-Msp。用电转化把重组质粒转入毕赤酵母GS115中,通过G418的抗性加压筛选得到高拷贝的转化子,经甲醇诱导、SDS-PAGE及Western-bolt分析,证实Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中获得了表达,产物大小约28KD,与预期大小相符。3.Myostatin前肽蛋白在大肠杆菌中的表达。设计含有SalⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物,扩增密码子优化且第76位天冬氨酸突变为丙氨酸的Myostatin前肽基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,测序后经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,将目的片段插入到原核表达质粒pMAL/c5x的多克隆位点,构建麦芽糖结合蛋白(MBP)与突变型Myostatin前肽基因的融合表达质粒pMAL/c5x-sMSTNProM。将重组表达质粒转化DH5α感受态细胞,筛选并鉴定的阳性重组菌经IPTG诱导表达了可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明该重组目的蛋白大小约为75KD,与预期大小相符。该蛋白的成功表达为后续的动物试验奠定了基础。4.Myostatin前肽蛋白对羔羊肌肉生长的影响,由于Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达量低,无法满足动物试验要求,因此本次免疫中选择在大肠杆菌中大量表达突变型Myostatin前肽蛋白免疫绵羊。选择7日龄左右的阿勒泰羔羊10只,随机分为2个组(试验组和对照组各5只),试验羔羊平均体重经过统计分析差异不显著,试验组注射突变型Myostatin前肽蛋白,注射剂量为0.5ml/只(Myostatin前肽蛋白浓度800μg/ml),对照组注射相同剂量的PBS,自试验羔羊7日龄开始进行肌肉注射,整个试验期共注射三次,每次间隔一周,试验期间测定试验羔羊生长发育,饲喂至4月龄进行屠宰,取腓肠肌样品进行HE染色,观察肌纤维的直径大小,Realtime-PCR检测Myostatin信号通路相关基因的表达。结果试验组羔羊体重、腿围、优质肉块重量(股二头肌、腓肠肌、半腱肌、股外侧肌)与对照组相比均无显著性差异;试验组平均单个肌束肌纤维细胞横断面积为1163.01μM~2,显著大于对照组的845.09μM~2(P0.05);试验组Myostatin、Smad3、p21表达量均低于对照组,而Myf5、MyoD、Myogenin的表达量均高于对照组,其中MyoD的表达量显著高于对照组(P0.05)。实验结果表明Myostatin前肽蛋白对Myostatin起到了抑制作用,促进了肌肉生长。5.Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备及对小鼠肌肉生长的影响。利用人工合成DNA的方法获得了密码子优化的乙肝表面抗原(HBsAg S)基因和羊Myostatin成熟肽的融合基因片段SM,将该融合基因SM克隆至基因疫苗专用载体pVAX1中,构建pV-SM重组质粒,并在BALB/c小鼠进行动物试验。选择出生20天左右、体重13-15g的雌性BALB/c小鼠20只,随机分成2个组(试验组和对照组各1个)试验组免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗,共计免疫三次,每次免疫间隔一周,每次免疫剂量25μl(Myostatin成熟肽核酸疫苗浓度800μg/ml),对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。试验期间测定试验小鼠体重,饲喂75天取腓肠肌样品进行HE染色,测定肌纤维直径以及抗体水平,并利用Realtime-PCR检测Myostatin信号通路下游及相关基因的表达。结果显示:试验组小鼠平均胴体重10.82±0.55g,显著高于对照组的8.28±0.29g(P0.05);试验组平均单个肌纤维横断面面积为1257.43±58.48μM~2,极显著的大于对照组的988.48±44.97μM~2(P0.01);试验组Myf5、MyoD、Myogenin的表达量均显著高于对照组(P0.05),Myostatin、Smad3表达量低于对照组,但经过统计分析,差异不显著(P0.05)。6.Myostatin成熟肽核酸疫苗对羔羊肌肉生长的影响。将7日龄阿勒泰母羔羊20只随机分为2个组,试验组和对照组各10只,试验组平均体重7.75±0.52kg,对照组7.88±0.63kg,经过统计分析差异不显著(P0.05)。试验组免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗,共免疫三次,每次免疫间隔一周,每次免疫剂量0.5ml(Myostatin成熟肽核酸疫苗浓度800μg/ml),对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。试验期间测定试验羔羊体重,饲喂155日龄进行屠宰,取腓肠肌样品进行HE染色,测定肌纤维直径及抗体水平,并利用Realtime-PCR检测Myostatin信号通路下游及相关基因的表达。结果显示:羔羊饲喂至155日龄时,试验组平均体重高于对照组,但经过统计分析差异不显著(P0.05);试验组平均胴体重为12.94±0.67kg,显著高于对照组的10.55±0.84kg(P0.05);试验组平均单个肌纤维横断面积为815.00±12.67μM~2,极显著高于对照组469.61±8.05μM~2(P0.01);试验组Myostatin的表达量极显著低于对照组(P0.01);试验组Smad3的表达量显著低于对照组(P0.05);试验组MyoD的表达量显著高于对照组(P0.05);试验组其他各项指标Myf5、Myogenin、p21的表达量均高于对照组,但统计分析差异不显著(P0.05)。结论:成功制备了突变型Myostatin前肽蛋白和Myostatin成熟肽核酸疫苗,并完成细胞分化和动物试验,证实了Myostatin前肽蛋白和Myostatin成熟肽核酸疫苗能抑制Myostatin的功能,具有促进动物肌肉生长的作用或趋势。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.4

【参考文献】
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