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《石河子大学》 2018年
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绵羊卵巢Leptin相关lncRNA筛选及在季节性发情中的分析研究

李良远  
【摘要】:绵羊季节性繁殖是绵羊为了适应环境而产生的一种保护行为。绵羊在非繁殖季节不出现发情表现,卵巢不会发生排卵,导致母羊一年只能产一胎,且羔羊出生也存在了季节性,是影响绵羊高效繁殖的主要限制性因素。季节性繁殖绵羊在乏情期营养状况好的情况下也可以出现发情现象。Leptin是一种多功能的细胞因子,在营养水平和繁殖过程的关联中起重要作用。LncRNA则是一种长度超过200个碱基且没有蛋白编码能力的转录本,能通过多种机制在许多生物过程中发挥重要的调控作用,包括转录调控、转录后控制和表观遗传过程。因此,本研究通过不同繁殖状态绵羊卵巢筛选季节性繁殖相关lncRNA和leptin相关lncRNA,为研究lncRNA在季节性繁殖调控中的分子机制提供理论基础。同时,通过结合不同繁殖状态绵羊卵巢繁殖激素受体的表达分析和血清样品中繁殖激素浓度检测,进一步了解卵巢的生理状态,为准确分析leptin相关lncRNA在绵羊季节性繁殖调控中的作用提供理论依据。目的:本研究以季节性发情的中国美利奴和常年发情的湖羊不同繁殖状态下的卵巢为研究对象,了解季节性繁殖绵羊卵巢生理状态,筛选与季节性发情相关的差异表达lncRNA和mRNA,分析leptin相关lncRNA在绵羊季节性繁殖中的调控作用。(1)探讨leptin长受体在下丘脑、子宫和卵巢中的表达变化与绵羊发情的相关性,分析后续试验的可行性。(2)准确采集不同繁殖状态绵羊卵巢组织,构建绵羊卵巢RNA测序文库并进行测序分析,为季节性繁殖相关转录组分析提供数据资源。(3)筛选季节性发情相关的差异表达lncRNA和mRNA以及leptin相关lncRNA,并分析其在季节性发情中的调控关系。(4)探究差异表达基因FSHR在中国美利奴羊和湖羊卵巢组织中的表达差异,并通过FSHR特异性表达的颗粒细胞对leptin与FSHR表达的进行相关性分析。通过本研究的实施,为系统描述lncRNA在季节性繁殖中的调控作用和绵羊的高效繁殖育种工作提供理论依据。方法:(1)利用不同发情时期绵羊的下丘脑、子宫、卵巢组织,提取总RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR技术检测样品中leptin长受体的表达,分析leptin长受体在绵羊不同发情阶段各组织中的表达变化。(2)采集常年发情的湖羊和季节性发情的中国美利奴不同繁殖状态的卵巢样品,提取总RNA构建RNA测序文库,通过Illumina Hiseq 2500平台进行RNA测序,并对转录本进行拼接组装。(3)使用CNCI、CPC、Pfam Scan和PhyloCSF对转录本进行编码潜能性分析,对lncRNA进行筛选并进行靶基因预测,分析季节性繁殖相关差异表达lncRNA和mRNA以及leptin相关lncRNA,开展GO分析、KEGG分析以及lncRNA-mRNA联合分析,分析lncRNA在季节性繁殖中的调控作用。(4)利用不同繁殖状态的卵巢样品,分析差异表达基因FSHR在季节性发情调控中的作用,结合颗粒细胞试验,分析leptin及其相关lncRNA在季节性发情调控中与差异表达基因FSHR的调控关系。结果:(1)相比下丘脑leptin长受体的表达,中国美利奴卵巢和子宫的表达量在发情期、发情间期和发情前期较低,而发情后期显著高于下丘脑。两品种绵羊同组织的leptin长受体的表达趋势相似,但中国美利奴的表达水平均高于多浪羊。(2)准确采集了季节性发情的中国美利奴和常年发情的湖羊不同繁殖状态的卵巢组织,乏情期卵巢表面无黄体和排卵点,卵巢PR和LHR以及黄体形成相关基因在乏情期卵巢中的表达类似于繁殖季节中国美利奴和湖羊的发情期。利用卵巢样品构建了6个特异性RNA-seq文库,共得到571,389,014条原始数据,获得纯净序列555,097,302条,共计83.27 Gb。每个文库中纯净数据占原始数据的比例大于96.74%,与绵羊基因组比对后,mapping率在79.18%以上,文库测序结果可靠性高,可用于后续的分析研究。(3)筛选出新型lncRNA 1473个,并筛选出乏情期与其它繁殖状态卵巢差异表达lncRNA 20个,差异表达mRNA 152个。差异表达lncRNA分析得到的共表达靶基因共有99个,占筛选所得的差异表达mRNA的65.1%,试验RNA测序数据可靠性高。通过RNA测序数据,筛选得到靶向leptin基因的lncRNA 1个,leptin受体基因相关lncRNA 9个。(4)在秋季,两品种绵羊相同生理状态的卵巢组织FSHR和ER的表达无差异。而在春季,中国美利奴乏情期卵巢ERα、ERβ和FSHR的表达显著高于湖羊发情期和间情期卵巢,但血清中E2和FSH的分泌趋势却与湖羊相似。中国美利奴卵巢ERα、ERβ和FSHR的表达在春季高于秋季,而湖羊间情期卵巢ERα、ERβ和FSHR的表达在春季显著低于秋季。颗粒细胞添加低浓度的leptin能够促进FSHR的表达,而高浓度则趋向于抑制,且leptin的添加能够促进颗粒细胞中黄体形成相关基因的表达。结论:(1)通过分析比较leptin长受体在不同绵羊品种不同发情时期的不同组织中的表达变化,发现leptin长受体的表达变化与绵羊发情存在一定的相关性。(2)乏情期卵巢无黄体和排卵点,基因表达分析及测序数据的相关性分析均表明,乏情期与湖羊春季发情期卵巢相关性较高。(3)筛选得到季节性发情相关的差异表达lncRNA和mRNA以及leptin相关lncRNA,了解了lncRNA在绵羊季节性发情调控中所涉及的生物功能以及lncRNA-mRNA的调控网络。(4)Leptin对FSHR的表达和黄体形成有一定的促进作用。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S826

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