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《石河子大学》 2006年
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猪囊尾蚴T24基因的克隆、表达与免疫原性分析

李海龙  
【摘要】: 从猪囊尾蚴中提取总RNA,用Oligo软件设计T24基因特异性引物,通过RT-PCR扩增出716bp的片段,扩增产物连接到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定、PCR分析和测序后证明,所克隆的716bp片段含T24蛋白基因完整的开放阅读框(ORF),其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与Genbank登录的T24基因相应序列的同源性分别是98%和100%。 将重组质粒pGEM-T24和原核表达载体pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ和SalⅠ酶切,亚克隆T24基因至原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,经酶切、PCR和测序鉴定证明,T24基因正确插入到pGEX-4T-1载体。用ITPG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-blotting分析证实T24基因在大肠杆菌中成功表达,目的蛋白与GST形成融合形式,分子量大小为40ku左右,能被猪囊尾蚴阳性血清所识别;将表达产物免疫小鼠,进行间接ELISA检测,其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的T24重组融合蛋白产物发生免疫学反应。 将重组质粒pGEM-T24和真核表达载体pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶切,亚克隆T24基因至真核表达载体pPIC9K中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆提取pPIC9K-T24。用SalⅠ内切酶线性化重组质粒pPIC9K-T24,然后电转化毕赤酵母GS115。采用G418浓度梯度法对所有在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子进行筛选,获得的高拷贝重组菌株。用PCR检测表明有目的基因整合。用1%甲醇诱导表达重组菌株,通过SDS-PAGE、Western-blotting对表达产物进行分析,结果表明T24基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物的分子量为21ku左右,能被人囊虫阳性血清所识别。本研究克隆了猪囊尾蚴T24基因,分别在原核和真核表达系统中进行了表达,证实其表达产物具有免疫原性,从而为研制猪囊尾蚴基因工程疫苗提供了理论依据和实验材料。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S852.7;S852.4

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【参考文献】
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