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《石河子大学》 2007年
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β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化多样性及定向合成GAMG的酶基因克隆与表达

王小艳  
【摘要】: 通过筛选和甘草酸转化结果分析,得到了三种不同转化类型的真菌,利用分子生物学和形态学方法进行了菌株鉴定,并对其进行了催化特性和催化动力学研究,针对定向合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的Penicillium sp. Li-3进行了β-D-葡萄糖醛酸苷酶的克隆与表达,研究结果如下: 三种不同转化类型的真菌经分子生物学和形态学方法鉴定为Penicillium purpurogenum Li-3、Aspergillus terreus Li-20和Aspergillus ustus Li-62,其转化甘草酸的产物分别是GAMG、GAMG与甘草次酸(GA)和GA。 三株菌所表达的β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究表明,Penicillium purpurogenum Li-3所产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的催化反应最适pH为4.2,最适温度为50℃,培养48h后开始产酶;Aspergillus terreus Li-20所产酶的催化反应最适pH为5.8,最适温度为45℃,培养24 h后开始产酶;而Aspergillus ustus Li-62所产酶的催化反应最适pH为6.2,最适温度为55℃,72h后才开始产酶。催化甘草酸的Km分别为0.328μmol·L-1、3.61 mmol·L-1和0.43 mmol·L-1,催化反应的最大速率Vmax分别为0.0035 mmol·L-1·min-1、0.034 mmol·L-1·min-1和0.106 mmol·L-1·min-1。 针对定向合成GAMG的Penicillium purpurogenum Li-3生长过程中存在的碳代谢阻遏现象,研究了该菌β-D-葡萄糖醛酸苷酶的高效诱导表达策略。建立了新的诱导产酶方法为,葡萄糖培养基中以32℃摇床(180rpm)培养,在葡萄糖耗尽时加入20%诱导剂(10g/L GL+1.2% Tween80)进行诱导,且每24h添加一次,诱导72h后转入到40℃摇床(180rpm)培养产酶,以该方法诱导产酶表明在5g/L葡萄糖中富集菌体,进行诱导后,酶活性从产酶基础培养基中的646U/mL提高到2356U/mL。 利用PCR方法从Penicillium purpurogenum Li-3基因组DNA中成功克隆到编码β-D-葡萄糖醛酸苷酶的基因Pgus,基因全长1815bp,编码604个氨基酸,分子量为67.6KDa。构建了Pgus的原核表达载体pET-28a(+)-Pgus和真核表达载体pPIC9K-Pgus,分别转化E.coli BL21(DE3)和Pichia pastoris GS115,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达后形成无酶活性的包涵体,转化Pichia pastoris GS115后已筛选到具有6~10个高拷贝的H is+ M u ts s型毕赤酵母重组菌。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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